انواع پروب FISH چیست؟ معرفی پروب‌های FISH و کاربرد هر نوع

هیبریداسیون درجا فلورسانس (Fluorescence In Situ Hybridization | FISH) یکی از روش‌های مهم سیتوژنتیک مولکولی برای شناسایی و تعیین موقعیت توالی‌های ژنتیکی در سلول‌ها و کروموزوم‌ها است. در این تکنیک، از پروب‌های اسید نوکلئیکی استفاده می‌شود که به توالی هدف مکمل خود متصل می‌شوند و با استفاده از برچسب فلورسنت، امکان مشاهده محل اتصال آن‌ها زیر میکروسکوپ فلورسانس فراهم می‌شود. یکی از عوامل مهم در نتیجه آزمایش FISH، انتخاب پروب مناسب است؛ زیرا هر پروب برای هدف مشخصی طراحی می‌شود و می‌تواند اطلاعات متفاوتی درباره تعداد کپی یک ناحیه ژنی، موقعیت یک توالی یا برخی ناهنجاری‌های کروموزومی ارائه دهد.

در این مقاله، ابتدا با ساختار و عملکرد پروب FISH آشنا می‌شویم و سپس انواع اصلی پروب‌های FISH، تفاوت آن‌ها، کاربرد هر نوع و روش‌های مختلف طراحی و برچسب‌گذاری پروب‌ها را بررسی می‌کنیم.

پروب FISH چیست و چه نقشی در آزمایش دارد؟

پروب FISH یک توالی اسید نوکلئیک طراحی‌شده است که برای شناسایی یک توالی هدف مشخص در DNA مورد استفاده قرار می‌گیرد. این پروب به‌گونه‌ای طراحی می‌شود که توالی آن با بخشی از توالی هدف مکمل باشد. پس از آماده‌سازی نمونه و ایجاد شرایط مناسب برای هیبریداسیون، پروب به توالی مکمل خود متصل می‌شود.

پروب FISH معمولاً با یک نشانگر فلورسنت برچسب‌گذاری می‌شود. برچسب‌گذاری می‌تواند به‌ صورت مستقیم، با اتصال فلوروفور به خود پروب، یا به‌ صورت غیرمستقیم و از طریق یک سامانه واسط انجام شود. پس از هیبریداسیون و شست‌وشوی پروب‌های متصل‌نشده، سیگنال حاصل با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مشاهده می‌شود.

به این ترتیب، محل مشاهده سیگنال فلورسنت می‌تواند اطلاعاتی درباره وجود، تعداد یا موقعیت توالی هدف در سلول یا کروموزوم ارائه دهد. برای مثال، بسته به نوع پروب و طراحی آزمایش، FISH می‌تواند در شناسایی برخی حذف‌ها، افزایش تعداد کپی‌ها و جابه‌جایی‌های کروموزومی مورد استفاده قرار گیرد.

نکته مهم این است که پروب FISH براساس هدف آزمایش انتخاب می‌شود. بنابراین، یک نوع پروب برای تمام آزمایش‌های FISH مناسب نیست. برخی پروب‌ها یک ناحیه مشخص از کروموزوم را هدف قرار می‌دهند، برخی برای شناسایی توالی‌های تکراری مانند نواحی سانترومری طراحی می‌شوند و برخی مجموعه‌ای از توالی‌ها را در امتداد یک کروموزوم پوشش می‌دهند. شناخت این تفاوت‌ها برای انتخاب صحیح پروب و تفسیر درست الگوی سیگنال‌های فلورسنت اهمیت دارد.

انواع اصلی پروب FISH کدام‌اند؟

پروب‌های FISH را می‌توان براساس ناحیه ژنومی مورد هدف به سه گروه اصلی تقسیم کرد:

1. پروب‌های اختصاصی لوکوس (Locus-Specific Probes)
2. پروب‌های توالی تکراری (Repetitive Sequence Probes)، مانند پروب‌های سانترومریک و تلومری
3. پروب‌های رنگ‌آمیزی کل کروموزوم (Whole Chromosome Painting Probes)

هر گروه برای بررسی نوع متفاوتی از توالی یا ناهنجاری ژنتیکی استفاده می‌شود. پروب اختصاصی اوکوس یک ژن یا ناحیه مشخص را هدف قرار می‌دهد، پروب‌های توالی تکراری به نواحی دارای توالی‌های تکرارشونده متصل می‌شوند و پروب‌های رنگ‌آمیزی کل کروموزوم مجموعه‌ای از توالی‌ها را در امتداد یک کروموزوم هدف قرار می‌دهند.

مقایسه انواع اصلی پروب FISH

نوع پروب	ناحیه هدف	کاربرد اصلی
اختصاصی لوکوس	ژن یا ناحیه مشخص کروموزومی	بررسی حذف، افزایش تعداد کپی و برخی بازآرایی‌ها
توالی تکراری	نواحی تکرارشونده مانند سانترومر و تلومر	بررسی تعداد کروموزوم‌ها و برخی ویژگی‌های ساختاری
رنگ‌آمیزی کل کروموزوم	مجموعه‌ای از توالی‌ها در طول یک کروموزوم	بررسی جابه‌جایی و بازآرایی‌های کروموزومی

در ادامه، هر یک از این انواع پروب FISH و کاربرد آن‌ها را بررسی می‌کنیم.قیق‌تر بررسی می‌کنیم.

پروب اختصاصی لوکوس (Locus-Specific Probe) چیست؟

پروب اختصاصی لوکوس (Locus-Specific Probe | LSP) نوعی پروب FISH است که برای شناسایی یک ژن یا ناحیه مشخص از ژنوم طراحی می‌شود. این پروب به توالی هدف در یک موقعیت مشخص از کروموزوم متصل می‌شود و سیگنال فلورسنت حاصل، امکان بررسی وجود یا تعداد نسخه‌های ناحیه موردنظر را فراهم می‌کند.

برخلاف پروب‌های رنگ‌آمیزی کل کروموزوم که مجموعه گسترده‌ای از توالی‌ها را در طول یک کروموزوم هدف قرار می‌دهند، LSP روی یک ناحیه ژنی یا کروموزومی مشخص تمرکز دارد. بنابراین، زمانی که سؤال آزمایش مربوط به یک ژن یا locus خاص باشد، این گروه از پروب‌ها کاربرد ویژه‌ای دارد.

کاربردهای پروب اختصاصی لوکوس

بسته به طراحی پروب، LSP می‌تواند برای بررسی تغییرات مختلف در یک ناحیه ژنومی مورد استفاده قرار گیرد، از جمله:

• حذف (Deletion): کاهش یا فقدان سیگنال مورد انتظار در ناحیه هدف
• افزایش تعداد کپی یا آمپلیفیکاسیون (Amplification): افزایش تعداد سیگنال‌های مربوط به ژن یا ناحیه هدف
• برخی بازآرایی‌ها و جابه‌جایی‌های کروموزومی: بررسی تغییرات ساختاری در ناحیه موردنظر
• تغییرات تعداد کپی (Copy Number Changes): ارزیابی تعداد نسخه‌های یک ناحیه ژنومی مشخص

در برخی طراحی‌ها، پروب هدف همراه با یک پروب مرجع استفاده می‌شود تا تفسیر الگوی سیگنال‌ها دقیق‌تر انجام شود.

پروب‌های Fusion و Break-Apart

پروب‌های اختصاصی لوکوس را می‌توان برای بررسی برخی بازآرایی‌های ژنی نیز به‌صورت Dual-Fusion یا Break-Apart طراحی کرد. در Dual-Fusion Probe، دو پروب با رنگ‌های متفاوت دو ژن یا ناحیه‌ای را هدف قرار می‌دهند که در صورت وقوع یک بازآرایی مشخص، به یکدیگر نزدیک یا با هم Fusion پیدا می‌کنند. این طراحی زمانی کاربرد دارد که شریک بازآرایی از قبل مشخص باشد.

در Break-Apart Probe، دو پروب در دو طرف یک ژن یا ناحیه هدف قرار می‌گیرند. به صورت طبیعی، سیگنال‌ها نزدیک یکدیگر هستند؛ در صورت ایجاد بازآرایی در ناحیه موردنظر، سیگنال‌ها از هم جدا می‌شوند. در این روش، برای شناسایی rearrangement یک ژن، لزوماً لازم نیست شریک بازآرایی از قبل مشخص باشد.

در نتیجه، Locus-Specific Probe یک گروه از پروب‌های هدفمند است، نه یک پروب با کاربرد واحد؛ نوع طراحی آن باید براساس ژن یا ناحیه موردنظر و نوع تغییر ژنتیکی انتخاب شود.

پروب‌های توالی تکراری؛ پروب‌های سانترومریک و تلومری

پروب‌های توالی تکراری (Repetitive Sequence Probes) توالی‌های تکرارشونده موجود در بخش‌های مشخصی از کروموزوم را هدف قرار می‌دهند. دو نمونه مهم از این گروه، پروب‌های سانترومریک و پروب‌های تلومری هستند.

پروب سانترومریک چیست؟

پروب سانترومریک (Centromeric Probe) برای شناسایی توالی‌های تکراری ناحیه سانترومر کروموزوم طراحی می‌شود. این پروب‌ها می‌توانند با ایجاد سیگنال فلورسنت، برای شمارش کروموزوم‌های هدف و بررسی برخی ناهنجاری‌های عددی مانند مونوزومی و تریزومی به کار روند.

یکی از کاربردهای مهم پروب‌های سانترومریک، بررسی الگوی تعداد سیگنال‌های یک کروموزوم در سلول است. البته تفسیر نتیجه باید براساس نوع پروب، نمونه و معیارهای معتبر همان آزمایش انجام شود.

پروب تلومری چیست؟

پروب تلومری (Telomeric Probe) توالی‌های تکراری موجود در انتهای کروموزوم‌ها را هدف قرار می‌دهد. توالی تکراری اصلی تلومرهای انسانی، TTAGGG است.

در برخی کاربردها، به‌جای توالی تلومری، نواحی نزدیک به انتهای کروموزوم با استفاده از پروب‌های زیرتلومری (Subtelomeric Probes) هدف قرار می‌گیرند. این دو را نباید یکسان در نظر گرفت؛ پروب تلومری توالی تکراری تلومر را هدف می‌گیرد، در حالی که پروب زیرتلومری یک ناحیه مشخص نزدیک انتهای کروموزوم را شناسایی می‌کند.

تفاوت پروب سانترومریک و تلومری

ویژگی	پروب سانترومریک	پروب تلومری
ناحیه هدف	سانترومر	انتهای کروموزوم
نوع توالی	تکراری سانترومری	تکراری تلومری
کاربرد شاخص	بررسی تعداد کروموزوم‌ها	مطالعه سیگنال‌ها و توالی‌های تلومری
نمونه هدف	توالی‌های آلفوئیدی	TTAGGG

در نتیجه، تفاوت اصلی این دو پروب در محل توالی هدف و نوع اطلاعات موردنظر از آزمایش FISH است. انتخاب پروب باید براساس سؤال آزمایش و ناحیه ژنومی مورد بررسی انجام شود.

پروب‌های رنگ‌آمیزی کل کروموزوم (Whole Chromosome Painting Probes) چیست؟

پروب‌های رنگ‌آمیزی کل کروموزوم (Whole Chromosome Painting Probes) مجموعه‌ای از پروب‌ها هستند که برای هدف قرار دادن توالی‌های متعدد در امتداد یک کروموزوم طراحی می‌شوند. این پروب‌ها با اتصال به نواحی مختلف کروموزوم و ایجاد سیگنال فلورسنت، امکان مشاهده و شناسایی گسترده‌تر آن کروموزوم را فراهم می‌کنند.

برخلاف پروب اختصاصی لوکوس که یک ژن یا ناحیه مشخص را هدف قرار می‌دهد، پروب‌های رنگ‌آمیزی کل کروموزوم برای بررسی ساختار گسترده‌تر کروموزوم و شناسایی برخی جابجایی‌ها و بازآرایی‌های کروموزومی به کار می‌روند.

پروب‌های رنگ‌آمیزی کل کروموزوم چگونه عمل می‌کنند؟

این پروب‌ها معمولاً از مجموعه‌ای از پروب‌های کوچک‌تر تشکیل می‌شوند که به توالی‌های مختلف در طول یک کروموزوم متصل می‌شوند. با برچسب‌گذاری فلورسنت، کروموزوم هدف با یک الگوی رنگی مشخص در زیر میکروسکوپ فلورسانس قابل مشاهده می‌شود.

در روش‌های چندرنگ مانند M-FISH (Multicolor FISH) و SKY (Spectral Karyotyping) می‌توان کروموزوم‌های مختلف را با رنگ‌ها یا الگوهای طیفی متفاوت مشخص کرد. این رویکرد به شناسایی و بررسی برخی بازآرایی‌های پیچیده کروموزومی کمک می‌کند.

کاربرد پروب‌های Whole Chromosome Painting

یکی از کاربردهای اصلی این پروب‌ها، بررسی تغییرات ساختاری و جابه‌جایی‌های کروموزومی است. وقتی بخشی از یک کروموزوم به کروموزوم دیگری منتقل شده باشد، تغییر در الگوی رنگ‌آمیزی می‌تواند به شناسایی این بازآرایی کمک کند.

بنابراین، Whole Chromosome Painting زمانی ارزش بیشتری دارد که هدف آزمایش، بررسی گسترده یک کروموزوم و بازآرایی‌های آن باشد؛ در حالی که برای بررسی یک ژن یا locus مشخص، معمولاً از پروب‌های اختصاصی لوکوس استفاده می‌شود.

تفاوت پروب رنگ‌آمیزی کل کروموزوم با پروب اختصاصی لوکوس

تفاوت این دو نوع پروب را می‌توان براساس محدوده هدف آن‌ها توضیح داد:

ویژگی	پروب اختصاصی مکان	پروب رنگ‌آمیزی کل کروموزوم
محدوده هدف	یک ژن یا ناحیه مشخص	مجموعه‌ای از توالی‌ها در طول یک کروموزوم
هدف اصلی	بررسی یک ناحیه ژنومی خاص	بررسی بازآرایی‌ها و تغییرات ساختاری گسترده‌تر
الگوی سیگنال	معمولاً سیگنال‌های موضعی	رنگ‌آمیزی بخش عمده یا کل کروموزوم هدف
کاربرد شاخص	حذف، افزایش تعداد کپی یا بازآرایی در ناحیه مشخص	بررسی جابه‌جایی‌ها و بازآرایی‌های کروموزومی

بنابراین، اگر سؤال آزمایش مربوط به یک ژن یا locus مشخص باشد، پروب اختصاصی مکان مناسب‌تر است؛ اما زمانی که هدف، بررسی گسترده‌تر ساختار کروموزوم و شناسایی بازآرایی‌های آن باشد، پروب‌های رنگ‌آمیزی کل کروموزوم می‌توانند اطلاعات متفاوتی ارائه دهند.

پروب‌های FISH از چه موادی ساخته می‌شوند؟

پروب‌های مورد استفاده در FISH می‌توانند از انواع مختلفی از اسیدهای نوکلئیک یا آنالوگ‌های اسید نوکلئیک ساخته شوند. انتخاب ماده و ساختار پروب به عواملی مانند توالی هدف، اندازه ناحیه مورد بررسی، حساسیت و اختصاصیت موردنیاز و نوع کاربرد آزمایش بستگی دارد.

از نظر علمی، DNA، الیگونوکلئوتید، PNA و LNA دقیقاً چهار نوع هم‌سطح از پروب نیستند. DNA و الیگونوکلئوتید به ماهیت و ساختار پروب مربوط می‌شوند، در حالی که PNA و LNA موادی با ساختار یا اصلاح شیمیایی متفاوت هستند که می‌توانند برای ساخت پروب‌های FISH با ویژگی‌های خاص مورد استفاده قرار گیرند.

پروب‌های DNA

پروب‌های DNA از متداول‌ترین انواع پروب‌های مورد استفاده در FISH به شمار می‌آیند. این پروب‌ها می‌توانند از منابع مختلفی مانند DNA کلون‌شده، پلاسمیدها و کلون‌های ژنومی تهیه شوند و براساس هدف آزمایش، یک ژن، ناحیه کروموزومی یا مجموعه‌ای از توالی‌ها را شناسایی کنند.

برای مثال، کلون‌های ژنومی مانند BAC (Bacterial Artificial Chromosome) می‌توانند به‌عنوان منبع DNA برای تهیه پروب‌های هدفمند مورد استفاده قرار گیرند. بنابراین، BAC را نباید یک «نوع شیمیایی مستقل از پروب» در نظر گرفت؛ بلکه یکی از منابع مورد استفاده برای تهیه برخی پروب‌های DNA است.

پروب‌های DNA می‌توانند برای شناسایی نواحی مشخص ژنومی و بررسی تغییراتی مانند حذف، افزایش تعداد کپی یا برخی بازآرایی‌های کروموزومی طراحی شوند.

پروب‌های الیگونوکلئوتیدی

الیگونوکلئوتیدها (Oligonucleotides) توالی‌های کوتاه و طراحی‌شده اسید نوکلئیک هستند که می‌توانند به‌عنوان پروب FISH مورد استفاده قرار گیرند. برخلاف برخی پروب‌های DNA که از قطعات ژنومی بزرگ‌تر تهیه می‌شوند، پروب‌های الیگونوکلئوتیدی را می‌توان بر اساس توالی هدف به‌صورت مستقیم و کنترل‌شده طراحی و سنتز کرد.

یکی از مزایای مهم این رویکرد، امکان طراحی تعداد زیادی الیگونوکلئوتید برای پوشش یک ناحیه ژنومی مشخص است. به همین دلیل، فناوری‌هایی مانند Oligo-FISH امکان طراحی مجموعه‌های پروبی با هدف شناسایی دقیق نواحی کروموزومی یا بررسی تغییرات ساختاری را فراهم کرده‌اند.

در طراحی پروب‌های الیگونوکلئوتیدی، عواملی مانند اختصاصیت توالی، دمای ذوب، ساختار ثانویه و دسترسی توالی هدف باید مورد توجه قرار گیرند.

پروب‌های PNA

PNA (Peptide Nucleic Acid) یک آنالوگ مصنوعی اسید نوکلئیک است که به‌جای ستون فقرات قندی-فسفاتی DNA، دارای ستون فقرات پپتیدی است. این ساختار متفاوت می‌تواند ویژگی‌های هیبریداسیون PNA را با DNA یا RNA تغییر دهد.

یکی از ویژگی‌های مهم PNA، خنثی بودن ستون فقرات آن است که باعث کاهش دافعه الکترواستاتیکی هنگام اتصال به DNA می‌شود. PNA می‌تواند میل اتصال بالایی به توالی مکمل داشته باشد و در برخی کاربردها، امکان دستیابی به حساسیت یا اختصاصیت مناسب با پروب‌های کوتاه را فراهم کند.

با وجود این مزایا، PNA برای همه کاربردهای FISH الزاماً انتخاب اول نیست و مزیت آن به نوع هدف، طراحی پروب و شرایط هیبریداسیون بستگی دارد.

پروب‌های LNA

LNA (Locked Nucleic Acid) نوعی آنالوگ اصلاح‌شده اسید نوکلئیک است که در آن ساختار قند نوکلئوتید به‌گونه‌ای اصلاح شده که ریبوز در یک آرایش ساختاری محدودشده قرار می‌گیرد. این ویژگی می‌تواند پایداری هیبرید پروب و توالی هدف را افزایش دهد.

استفاده از نوکلئوتیدهای LNA در پروب‌ها می‌تواند میل اتصال به توالی مکمل و توانایی تمایز میان توالی‌های کاملاً مکمل و دارای mismatch را بهبود دهد. به همین دلیل، پروب‌های حاوی LNA در برخی کاربردهای FISH، به‌ ویژه زمانی که هدف یک توالی کوتاه یا نیازمند اختصاصیت بالاست، مورد توجه قرار گرفته‌اند.

در عمل، LNA می‌تواند به‌ صورت بخشی از یک پروب الیگونوکلئوتیدی مورد استفاده قرار گیرد؛ بنابراین، LNA را نیز نباید صرفاً به‌ عنوان یک گروه کاملاً جدا از oligonucleotide در نظر گرفت.

مقایسه مواد و ساختارهای مورد استفاده در پروب FISH

نوع پروب یا ماده	ویژگی اصلی	کاربرد یا مزیت شاخص
DNA	اسید نوکلئیک کلاسیک برای ساخت پروب	هدف‌گیری ژن‌ها و نواحی کروموزومی مختلف
الیگونوکلئوتید	توالی کوتاه و قابل سنتز و طراحی	طراحی دقیق توالی و امکان استفاده از مجموعه‌های متعدد پروب
PNA	آنالوگ اسید نوکلئیک با ستون فقرات پپتیدی	میل اتصال بالا و ویژگی‌های مناسب برای برخی اهداف دشوار
LNA	اسید نوکلئیک اصلاح‌شده با ساختار قندی محدودشده	افزایش پایداری هیبرید و بهبود تمایز توالی

در نتیجه، انتخاب ماده مناسب برای پروب FISH تنها به این موضوع محدود نمی‌شود که کدام ماده «بهتر» است. نوع توالی هدف، اندازه ناحیه مورد بررسی، سطح اختصاصیت موردنیاز و شرایط آزمایش تعیین می‌کنند که استفاده از یک پروب DNA، الیگونوکلئوتیدی یا پروب‌های حاوی PNA یا LNA چه مزیتی داشته باشد.

روش‌های برچسب‌گذاری پروب FISH

برای اینکه اتصال پروب به توالی هدف در تکنیک FISH قابل مشاهده باشد، پروب باید به یک نشانگر قابل آشکارسازی مجهز شود. یکی از روش‌های رایج، استفاده از نشانگرهای فلورسنت است که امکان مشاهده سیگنال حاصل از هیبریداسیون را با میکروسکوپ فلورسانس فراهم می‌کنند.

برچسب‌گذاری پروب FISH را می‌توان به دو روش اصلی انجام داد:

برچسب‌گذاری مستقیم (Direct Labeling)

در این روش، فلوروفور مستقیماً به پروب متصل می‌شود. پس از هیبریداسیون پروب با توالی هدف و شست‌وشوی پروب‌های اضافی، سیگنال فلورسنت مستقیماً قابل مشاهده است. مزیت اصلی این روش، ساده‌تر بودن فرایند آشکارسازی است؛ زیرا به مرحله تشخیص ثانویه نیاز ندارد.

برچسب‌گذاری غیرمستقیم (Indirect Labeling)

در برچسب‌گذاری غیرمستقیم، فلوروفور مستقیماً روی پروب قرار نمی‌گیرد. در عوض، پروب دارای یک نشانگر واسط است که پس از هیبریداسیون توسط یک عامل تشخیص‌دهنده حاوی فلوروفور شناسایی می‌شود. این روش می‌تواند امکان تقویت سیگنال و انعطاف‌پذیری بیشتر در آشکارسازی را فراهم کند.

در نهایت، انتخاب روش برچسب‌گذاری به نوع پروب، هدف آزمایش و روش آشکارسازی مورد استفاده بستگی دارد.

چگونه پروب مناسب FISH را انتخاب کنیم؟

انتخاب پروب مناسب FISH باید براساس سؤال آزمایش و نوع تغییر ژنتیکی موردنظر انجام شود. ابتدا باید مشخص شود هدف، بررسی یک ژن یا ناحیه مشخص، تعیین تعداد کروموزوم، شناسایی یک Fusion یا بررسی یک بازآرایی گسترده کروموزومی است. سپس نوع پروب متناسب با این هدف انتخاب می‌شود.

انتخاب پروب FISH براساس هدف آزمایش

هدف آزمایش	پروب مناسب	کاربرد
بررسی حذف یا افزایش تعداد کپی یک ژن یا ناحیه مشخص	Locus-Specific	بررسی یک ناحیه ژنومی هدف
بررسی تعداد یک کروموزوم یا آنیوپلوئیدی	Centromeric	شمارش سیگنال‌های کروموزومی
بررسی توالی‌های انتهایی کروموزوم	Telomeric / Subtelomeric	مطالعه تلومر یا نواحی نزدیک به انتهای کروموزوم
شناسایی یک Fusion مشخص	Dual-Fusion	بررسی بازآرایی بین دو ژن یا ناحیه شناخته‌شده
شناسایی بازآرایی یک ژن بدون مشخص بودن شریک آن	Break-Apart	بررسی rearrangement یک ژن هدف
بررسی بازآرایی‌های گسترده کروموزومی	Whole Chromosome Painting	شناسایی جابه‌جایی و بازآرایی‌های ساختاری

چه عواملی در انتخاب پروب اهمیت دارند؟

علاوه بر نوع ناهنجاری، ناحیه ژنومی هدف، نوع نمونه، وضعیت سلول‌ها، کیفیت آماده‌سازی و معیارهای تفسیر نیز باید در انتخاب و ارزیابی پروب مورد توجه قرار گیرند. برای مثال، نوع اطلاعات حاصل از FISH متافازی و اینترفازی یکسان نیست. FISH متافازی می‌تواند اطلاعاتی درباره جایگاه کروموزومی ارائه دهد، در حالی که FISH اینترفازی برای بررسی برخی تغییرات هدفمند مانند حذف، آمپلیفیکاسیون و Fusion قابل استفاده است.

در نتیجه، انتخاب پروب FISH باید از هدف آزمایش شروع شود و براساس نوع توالی و ناهنجاری موردنظر ادامه پیدا کند؛ یک نوع پروب برای همه کاربردهای FISH مناسب نیست.

کاربردهای پروب FISH

کاربرد پروب FISH به ناحیه هدف و نوع تغییر ژنتیکی موردنظر بستگی دارد. به همین دلیل، انواع مختلف پروب برای پاسخ به سؤالات متفاوت در سیتوژنتیک و ژنتیک مولکولی طراحی می‌شوند.

مهم‌ترین کاربردهای پروب FISH عبارت‌اند از:

• بررسی ناهنجاری‌های عددی کروموزوم: پروب‌های سانترومریک می‌توانند برای شمارش سیگنال‌های یک کروموزوم و بررسی الگوهایی مانند مونوزومی و تریزومی استفاده شوند.
• شناسایی حذف و افزایش تعداد کپی: پروب‌های اختصاصی لوکوس برای بررسی حذف، افزایش تعداد کپی و آمپلیفیکاسیون در یک ناحیه مشخص کاربرد دارند.
• شناسایی بازآرایی‌های ژنی و کروموزومی: طراحی‌های Dual-Fusion و Break-Apart برای بررسی برخی Fusionها و rearrangementهای ژنی استفاده می‌شوند.
• بررسی بازآرایی‌های ساختاری کروموزوم‌ها: پروب‌های Whole Chromosome Painting، به‌ ویژه در روش‌هایی مانند M-FISH و SKY، برای مطالعه بازآرایی‌های گسترده کروموزومی کاربرد دارند.
• مطالعات سیتوژنتیک و پژوهشی: پروب‌های FISH در بررسی ساختار کروموزوم‌ها، تغییرات ژنتیکی و برخی مطالعات مرتبط با بیماری‌ها نیز استفاده می‌شوند.

جمع‌بندی

پروب FISH با اتصال اختصاصی به توالی هدف، امکان شناسایی و بررسی برخی تغییرات ژنتیکی و کروموزومی را در سلول‌ها فراهم می‌کند. انواع پروب FISH براساس ناحیه هدف و سؤال آزمایش با یکدیگر تفاوت دارند.

به‌ طور کلی، پروب‌های FISH شامل پروب‌های اختصاصی لوکوس، پروب‌های توالی تکراری و پروب‌های رنگ‌آمیزی کل کروموزوم هستند. علاوه بر این، پروب‌ها می‌توانند با استفاده از ساختارهایی مانند DNA، الیگونوکلئوتید و در برخی کاربردها PNA یا LNA طراحی شوند.

بنابراین، انتخاب پروب مناسب باید براساس هدف آزمایش، نوع ناهنجاری ژنتیکی، ناحیه موردنظر و ویژگی‌های نمونه انجام شود. انتخاب صحیح پروب و طراحی مناسب آزمون، نقش مهمی در دستیابی به نتایج قابل اعتماد در FISH دارد.

منبع: pmc، ncbi، genome