چگونه تکنیک‌های سیتوژنتیک مناسب را انتخاب کنیم؟ راهنمای مقایسه روش‌ها

تکنیک‌های سیتوژنتیک مجموعه‌ای از روش‌های تخصصی در علم ژنتیک هستند که برای بررسی تعداد، ساختار و تغییرات کروموزوم‌ها به کار می‌روند. این روش‌ها به پژوهشگران و پزشکان کمک می‌کنند ناهنجاری‌های کروموزومی را شناسایی و ارزیابی کنند؛ ناهنجاری‌هایی که می‌توانند با برخی بیماری‌های ژنتیکی، اختلالات رشد و نمو و سرطان‌ها مرتبط باشند. سیتوژنتیک به‌ عنوان یکی از شاخه‌های مهم ژنتیک، در تحقیقات زیست‌پزشکی و تشخیص‌های بالینی کاربرد گسترده‌ای دارد و به‌ ویژه در تشخیص پیش از تولد، بررسی ناباروری، تشخیص و طبقه‌ بندی برخی سرطان‌ها و ارزیابی بیماری‌های ژنتیکی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

ناهنجاری‌های کروموزومی می‌توانند از تغییرات عددی، مانند اضافه یا حذف یک کروموزوم کامل، تا تغییرات ساختاری کروموزوم‌ها مانند حذف، دوپلیکاسیون، جابه‌جایی و وارونگی متغیر باشند. برای شناسایی و ارزیابی این تغییرات، روش‌های مختلف سیتوژنتیک، سیتوژنتیک مولکولی و ژنتیک مولکولی به کار گرفته می‌شوند.

انتخاب روش مناسب به نوع، اندازه و ماهیت تغییر ژنتیکی، ویژگی نمونه و همچنین هدف آزمایش بستگی دارد؛ برای مثال، کاریوتایپ برای بررسی ناهنجاری‌های عددی و ساختاری نسبتاً بزرگ مناسب است، در حالی که FISH امکان بررسی هدفمند یک ناحیه مشخص را فراهم می‌کند. روش‌های آرایه‌ای مانند Array-CGH برای شناسایی تغییرات تعداد کپی (CNV) در گستره وسیعی از ژنوم کاربرد دارند و روش‌های مولکولی مانند QF-PCR برای تشخیص سریع برخی آنیوپلوئیدی‌های هدف و NGS برای شناسایی طیف گسترده‌ای از واریانت‌های ژنتیکی مورد استفاده قرار می‌گیرند. بنابراین، شناخت قابلیت‌ها و محدودیت‌های هر روش و انتخاب تکنیک مناسب بر اساس نوع ناهنجاری و هدف آزمایش، نقش مهمی در دستیابی به نتایج دقیق و قابل تفسیر در پژوهش‌ها و تشخیص‌های بالینی دارد.

روش‌های بررسی ناهنجاری‌های کروموزومی و ژنومی

روش‌های بررسی ناهنجاری‌های کروموزومی و ژنومی شامل تکنیک‌های کلاسیک سیتوژنتیک، روش‌های سیتوژنتیک مولکولی، فناوری‌های آرایه‌ای و برخی روش‌های ژنتیک مولکولی هستند. هر یک از این روش‌ها از نظر دامنه بررسی، وضوح، سرعت، نوع تغییرات قابل شناسایی و نیاز به نمونه یا تجهیزات، قابلیت‌ها و محدودیت‌های متفاوتی دارند.

کاریوتایپ به‌عنوان یکی از روش‌های پایه سیتوژنتیک، امکان بررسی تعداد و ساختار کلی کروموزوم‌ها را فراهم می‌کند. FISH یک روش سیتوژنتیک مولکولی هدفمند است که برای بررسی نواحی یا تغییرات مشخص به کار می‌رود. QF-PCR در دسته روش‌های ژنتیک مولکولی قرار می‌گیرد و برای تشخیص سریع برخی آنیوپلوئیدی‌های هدف کاربرد دارد. روش‌های آرایه‌ای مانند Array-CGH امکان بررسی گسترده ژنوم و شناسایی تغییرات تعداد کپی (CNV) را فراهم می‌کنند. در کنار این روش‌ها، فناوری‌های توالی‌یابی مانند NGS نیز برای شناسایی انواع مختلف واریانت‌های ژنتیکی و در برخی طراحی‌ها، برخی تغییرات ساختاری و تعداد کپی به کار می‌روند.

شناخت تفاوت‌های این روش‌ها به پژوهشگران و متخصصان کمک می‌کند بر اساس نوع ناهنجاری مورد انتظار، ویژگی نمونه و هدف آزمایش، مناسب‌ترین روش یا ترکیبی از روش‌ها را انتخاب کنند. در ادامه، مهم‌ترین روش‌های مورد استفاده برای بررسی تغییرات کروموزومی و ژنومی با یکدیگر مقایسه می‌شوند.

جدول مقایسه‌ای روش‌های بررسی ناهنجاری‌های کروموزومی و ژنومی

روش	دسته روش	کاربرد اصلی	مزایا	محدودیت‌ها
کاریوتایپ (Karyotyping)	سیتوژنتیک کلاسیک	بررسی آنیوپلوئیدی‌ها و ناهنجاری‌های ساختاری نسبتاً بزرگ کروموزوم‌ها	بررسی هم‌زمان تعداد و ساختار کلی کروموزوم‌ها؛ امکان شناسایی برخی جابه‌جایی‌ها و وارونگی‌های متعادل	وضوح محدود؛ نیاز به سلول‌های زنده و قابل تقسیم و در بسیاری از نمونه‌ها نیازمند کشت سلولی
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)	سیتوژنتیک مولکولی	شناسایی هدفمند برخی تغییرات کروموزومی و ژنومی در نواحی مشخص	وضوح بالاتر از کاریوتایپ در ناحیه هدف؛ امکان بررسی هسته‌های اینترفازی؛ سرعت مناسب	وابسته به پروب اختصاصی؛ مناسب نبودن برای بررسی جامع و ناشناخته کل ژنوم
QF-PCR	ژنتیک مولکولی	تشخیص سریع آنیوپلوئیدی‌های شایع، به‌ویژه کروموزوم‌های ۱۳، ۱۸، ۲۱، X و Y	سریع، مقرون‌به‌صرفه و بدون نیاز به کشت سلولی	محدود به کروموزوم‌ها و مارکرهای هدف؛ مناسب نبودن برای بررسی جامع ناهنجاری‌های ساختاری
Array-CGH (aCGH)	سیتوژنتیک مولکولی / ژنومیک	شناسایی تغییرات تعداد کپی (CNV) در گستره وسیعی از ژنوم	وضوح بالاتر از کاریوتایپ؛ بررسی گسترده ژنوم برای شناسایی حذف‌ها و افزایش‌های تعداد کپی	شناسایی نکردن جابه‌جایی‌ها و وارونگی‌های متعادل؛ نیاز به تجهیزات و تحلیل تخصصی
NGS (توالی‌یابی نسل جدید)	ژنتیک مولکولی / ژنومیک	شناسایی طیف گسترده‌ای از واریانت‌های ژنتیکی و در برخی طراحی‌ها، برخی CNVها و تغییرات ساختاری	توان پردازش بالا؛ امکان بررسی هم‌زمان تعداد زیادی از نواحی ژنومی	هزینه و پیچیدگی تحلیل؛ قابلیت تشخیص به نوع آزمایش، پلتفرم، پوشش و روش تحلیل وابسته است

۱. کاریوتایپ (Karyotyping)

کاریوتایپ یکی از قدیمی‌ترین و همچنان پرکاربردترین روش‌های سیتوژنتیک است که در بسیاری از آزمایشگاه‌های ژنتیک پزشکی برای بررسی ناهنجاری‌های عددی و ساختاری کروموزوم‌ها استفاده می‌شود. در این روش، تعداد، اندازه، شکل و الگوی باندی کروموزوم‌ها بررسی می‌شود. معمولاً سلول‌ها در مرحله متافاز متوقف می‌شوند تا کروموزوم‌ها در حالت متراکم و قابل مشاهده قرار داشته باشند. سپس کروموزوم‌ها بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیک و الگوی باندی مرتب شده و در قالب کاریوگرام (Karyogram) نمایش داده می‌شوند.

برای شناسایی کروموزوم‌ها و بررسی دقیق‌تر ساختار آن‌ها، از روش‌های رنگ‌آمیزی و باندینگ مانند G-banding استفاده می‌شود که الگوهای مشخصی از نوارهای روشن و تیره روی کروموزوم‌ها ایجاد می‌کند. روش‌هایی مانند R-banding و Q-banding نیز در برخی شرایط کاربرد دارند. همچنین روش‌های FISH چندرنگی مانند Chromosome Painting می‌توانند در موارد خاص به‌ عنوان روش مکمل برای بررسی برخی ناهنجاری‌های ساختاری کروموزوم‌ها مورد استفاده قرار گیرند.

کاربردهای کاریوتایپ

• شناسایی آنیوپلوئیدی‌ها و سایر ناهنجاری‌های عددی کروموزومی، مانند تریزومی ۲۱ (سندرم داون) و مونوزومی X (سندرم ترنر)

• شناسایی ناهنجاری‌های ساختاری نسبتاً بزرگ، از جمله حذف، دوپلیکاسیون، وارونگی و جابه‌جایی‌های متعادل یا نامتعادل
• بررسی برخی اختلالات کروموزومی مانند سندرم کری‌دو‌شا (Cri-du-chat)
• بررسی برخی موارد ناباروری و سقط مکرر، به‌ویژه در صورت احتمال وجود ناهنجاری‌های کروموزومی
• بررسی برخی ناهنجاری‌های کروموزومی در سرطان‌ها و بیماری‌های هماتولوژیک

مزایای کاریوتایپ

• هزینه نسبتاً پایین در مقایسه با برخی روش‌های ژنومی پیشرفته
• امکان بررسی هم‌زمان تعداد و ساختار کلی کروموزوم‌ها
• امکان شناسایی برخی جابه‌جایی‌ها و وارونگی‌های متعادل که ممکن است در روش‌های مبتنی بر بررسی تغییرات تعداد کپی شناسایی نشوند
• مناسب بودن برای بررسی ناهنجاری‌های کروموزومی بزرگ و تغییرات عددی

محدودیت‌های کاریوتایپ

• وضوح محدود؛ کاریوتایپ استاندارد معمولاً برای شناسایی ناهنجاری‌های در محدوده حدود ۵ تا ۱۰ مگاباز و بزرگ‌تر مناسب‌تر است و بسیاری از تغییرات زیرمیکروسکوپی را شناسایی نمی‌کند. وضوح واقعی به کیفیت باندینگ و آماده‌سازی کروموزوم‌ها نیز بستگی دارد.
• نیاز به سلول‌های زنده و قابل تقسیم و در بسیاری از نمونه‌ها نیازمند کشت سلولی است؛ بنابراین انجام آزمایش می‌تواند نسبت به برخی روش‌های DNAمحور زمان‌برتر باشد.
• انجام و تفسیر نتایج به تجهیزات مناسب و نیروی متخصص و باتجربه نیاز دارد.

۲. هیبریداسیون درجا با فلورسانس (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH)

FISH یکی از روش‌های سیتوژنتیک مولکولی است که برای شناسایی هدفمند تغییرات کروموزومی و ژنومی در یک ناحیه مشخص به کار می‌رود. در این روش، از پروب‌های DNA نشاندارشده با مواد فلورسنت استفاده می‌شود که به توالی‌های مکمل و اختصاصی در کروموزوم یا هسته سلول متصل می‌شوند. سپس سیگنال‌های فلورسنت با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مشاهده و بر اساس الگوی سیگنال‌ها، وجود یا عدم وجود تغییر مورد نظر بررسی می‌شود.

یکی از مزیت‌های مهم FISH نسبت به کاریوتایپ، امکان بررسی مستقیم یک ناحیه هدف با وضوح بالاتر است. همچنین در بسیاری از کاربردها می‌توان FISH را روی هسته‌های اینترفازی انجام داد و به همین دلیل، برای برخی آزمایش‌ها نیازی به انتظار برای تشکیل متافاز و کشت طولانی‌مدت سلولی وجود ندارد. با این حال، میزان وضوح و قابلیت تشخیص تغییرات به نوع پروب و طراحی آزمایش وابسته است.

کاربردهای FISH

• شناسایی هدفمند برخی ناهنجاری‌های کروموزومی مانند جابه‌جایی‌ها (Translocations)، حذف‌ها (Deletions)، افزایش تعداد کپی و برخی فیوژن‌های ژنی (Gene Fusions)
• بررسی سریع برخی ناهنجاری‌های کروموزومی شناخته‌شده در نمونه‌های پیش از تولد
• شناسایی و بررسی برخی تغییرات ژنومی در سرطان‌ها، از جمله برخی لوسمی‌ها و لنفوم‌ها
• بررسی وجود و موقعیت برخی توالی‌های ویروسی ادغام‌شده در ژنوم سلول میزبان
• تأیید برخی ناهنجاری‌های کروموزومی یا ژنومی شناخته‌شده بر اساس یافته‌های بالینی یا نتایج سایر آزمایش‌ها

مزایای تکنیک FISH

• امکان انجام آزمایش روی هسته‌های اینترفازی و برخی نمونه‌های ثابت‌شده، که در بسیاری از کاربردها نیاز به کشت طولانی‌مدت سلولی را کاهش می‌دهد
• وضوح بالاتر نسبت به کاریوتایپ برای بررسی نواحی هدف؛ میزان وضوح به نوع پروب و طراحی آزمایش بستگی دارد
• سرعت مناسب در بررسی تغییرات هدفمند و امکان شمارش و ارزیابی سیگنال‌های فلورسنت در تعداد زیادی سلول
• امکان استفاده از چند پروب یا نشانگر فلورسنت در برخی روش‌های چندرنگی برای بررسی هم‌زمان چند هدف مشخص

محدودیت‌های تکنیک FISH

• وابستگی به طراحی و انتخاب پروب اختصاصی و در نتیجه مناسب نبودن برای شناسایی تغییرات ناشناخته یا بررسی جامع کل ژنوم
• امکان بررسی تعداد محدودی از نواحی یا اهداف مشخص در هر آزمایش
• در صورت مشخص نبودن ناحیه یا تغییر مورد نظر، FISH به‌تنهایی نمی‌تواند جایگزین روش‌های گسترده‌تر مانند کاریوتایپ یا روش‌های آرایه‌ای شود

۳. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز فلورسانس کمی (Quantitative Fluorescence PCR – QF-PCR)

QF-PCR یک روش ژنتیک مولکولی سریع برای شناسایی برخی آنیوپلوئیدی‌های کروموزومی است که به‌ویژه در تشخیص سریع تریزومی‌ها و ناهنجاری‌های کروموزوم‌های جنسی کاربرد دارد. در این روش، از پرایمرهای نشاندارشده با فلورسانس برای تکثیر مارکرهای STR (Short Tandem Repeat) در نواحی مشخصی از کروموزوم‌های هدف استفاده می‌شود. سپس محصولات PCR بر اساس اندازه قطعات و شدت سیگنال فلورسنت تحلیل می‌شوند. الگوی به‌دست‌آمده از مارکرها می‌تواند اطلاعاتی درباره تعداد نسبی نسخه‌های کروموزوم مورد بررسی ارائه دهد و به شناسایی آنیوپلوئیدی کمک کند.

کاربردهای QF-PCR

• تشخیص سریع تریزومی‌های شایع کروموزوم‌های ۲۱ (سندرم داون)، ۱۸ (سندرم ادوارد) و ۱۳ (سندرم پاتو)
• شناسایی برخی آنیوپلوئیدی‌های کروموزوم‌های جنسی، از جمله مونوزومی X (سندرم ترنر) و XXY (سندرم کلاین‌فلتر)
• تشخیص سریع برخی آنیوپلوئیدی‌های شایع در نمونه‌های پیش از تولد، به‌ویژه در مواردی که دریافت سریع نتیجه اهمیت دارد

مزایای QF-PCR

• عدم نیاز به کشت سلولی و امکان انجام آزمایش با DNA استخراج‌شده از نمونه
• سرعت بالا و هزینه نسبتاً مناسب در مقایسه با برخی روش‌های ژنتیکی گسترده‌تر
• قابلیت استفاده در آزمایش‌های روتین برای بررسی آنیوپلوئیدی‌های هدف
• امکان ارائه نتیجه سریع‌تر از کاریوتایپ در بسیاری از کاربردهای تشخیصی

محدودیت‌های QF-PCR

• محدود بودن آزمایش به کروموزوم‌ها و مارکرهای هدف و در نتیجه مناسب نبودن برای بررسی جامع کل ژنوم
• هموزیگوت بودن برخی مارکرهای STR می‌تواند قدرت تفسیر نتیجه را کاهش دهد و در برخی موارد استفاده از مارکرهای بیشتر را ضروری کند
• مناسب نبودن برای شناسایی بسیاری از ناهنجاری‌های ساختاری، تغییرات تعداد کپی کوچک و سایر واریانت‌های ژنتیکی
• طبیعی بودن نتیجه QF-PCR، همه انواع ناهنجاری‌های کروموزومی را رد نمی‌کند و در صورت وجود اندیکاسیون بالینی، ممکن است انجام روش‌های تکمیلی مانند کاریوتایپ یا روش‌های آرایه‌ای ضرورت داشته باشد

۴. هیبریداسیون ژنومی مقایسه‌ای و Array-CGH (Comparative Genomic Hybridization – CGH / Array-CGH)

هیبریداسیون ژنومی مقایسه‌ای (Comparative Genomic Hybridization – CGH) یکی از روش‌های سیتوژنتیک مولکولی برای شناسایی عدم تعادل‌های ژنومی، به‌ ویژه افزایش و کاهش تعداد کپی DNA، است. در CGH سنتی، DNA نمونه مورد آزمایش و DNA مرجع با رنگ‌های فلورسنت متفاوت نشاندار شده و به‌صورت رقابتی روی کروموزوم‌های متافازی هیبرید می‌شوند. با مقایسه شدت سیگنال‌های دو نمونه در طول کروموزوم‌ها، می‌توان نواحی دارای افزایش یا کاهش ماده ژنتیکی را شناسایی کرد.

Array-CGH (aCGH) نسخه آرایه‌ای این فناوری است که در آن به جای کروموزوم‌های متافازی، از مجموعه‌ای متراکم از پروب‌های DNA، مانند الیگونوکلئوتیدها یا قطعات DNA مشتق از BAC، روی یک آرایه استفاده می‌شود. aCGH با افزایش تعداد و تراکم پروب‌ها، امکان بررسی گسترده ژنوم با وضوح بالاتر از CGH سنتی را فراهم می‌کند و عمدتاً برای شناسایی تغییرات تعداد کپی (Copy Number Variations – CNVs)، از جمله حذف‌ها و افزایش‌های قطعات DNA، به کار می‌رود.

مکانیسم عملکرد CGH و Array-CGH

در روش CGH و aCGH، DNA نمونه مورد آزمایش و DNA مرجع با رنگ‌های فلورسنت متفاوت نشاندار می‌شوند و سپس به‌صورت رقابتی روی بستر هیبریداسیون قرار می‌گیرند.

در CGH سنتی، بستر هیبریداسیون کروموزوم‌های متافازی است؛ در حالی که در aCGH، DNA نمونه و مرجع روی مجموعه‌ای از پروب‌های DNA قرارگرفته روی آرایه هیبرید می‌شوند.

پس از هیبریداسیون، نسبت سیگنال فلورسنت نمونه مورد آزمایش به نمونه مرجع در هر ناحیه اندازه‌گیری می‌شود. افزایش یا کاهش این نسبت می‌تواند نشان‌دهنده افزایش یا کاهش تعداد کپی DNA در آن ناحیه باشد.

در aCGH، داده‌های حاصل معمولاً به‌صورت نمودارهای ژنومی نمایش داده می‌شوند و می‌توانند نمایی از تغییرات تعداد کپی در سراسر ژنوم ارائه دهند.

Array-CGH و کاریوتایپ مجازی

آرایه‌های aCGH می‌توانند از پروب‌های الیگونوکلئوتیدی یا قطعات DNA مانند BAC تشکیل شده باشند که روی یک اسلاید یا بستر اختصاصی آرایه قرار گرفته‌اند. تراکم و توزیع این پروب‌ها تعیین می‌کند که روش در مناطق مختلف ژنوم چه وضوحی داشته باشد.

نتایج aCGH را می‌توان به شکل یک کاریوتایپ مجازی (Virtual Karyotype) یا نمای گرافیکی از تغییرات تعداد کپی ژنوم نمایش داد. با این حال، کاریوتایپ مجازی جایگزین کاریوتایپ سیتوژنتیک از نظر مشاهده مستقیم ساختار کروموزوم‌ها نیست و عمدتاً اطلاعات مربوط به عدم تعادل‌های ژنومی را نمایش می‌دهد.

وضوح aCGH یک مقدار ثابت نیست و به طراحی آرایه، تراکم پروب‌ها و ناحیه مورد بررسی بستگی دارد. آرایه‌های با تراکم بالاتر یا آرایه‌های هدفمند می‌توانند در نواحی مشخص، وضوح بیشتری نسبت به آرایه‌های با پوشش عمومی ژنوم ارائه دهند.

کاربردهای Array-CGH

• شناسایی حذف‌ها و افزایش‌های تعداد کپی (CNV) در گستره وسیعی از ژنوم
• بررسی ناهنجاری‌های ژنومی در بیماران مبتلا به اختلالات رشدی، ناهنجاری‌های مادرزادی و برخی بیماری‌های ژنتیکی
• شناسایی برخی تغییرات تعداد کپی در نمونه‌های توموری و مطالعات سرطان
• بررسی ناهنجاری‌های ژنومی زیرمیکروسکوپی که ممکن است با کاریوتایپ استاندارد قابل شناسایی نباشند
• استفاده در مطالعات ژنومی و برخی کاربردهای پزشکی شخصی‌سازی‌شده

مزایای Array-CGH

• وضوح بالاتر نسبت به کاریوتایپ برای شناسایی بسیاری از CNVهای زیرمیکروسکوپی
• امکان بررسی گسترده ژنوم در یک آزمایش
• عدم نیاز به مشاهده مستقیم کروموزوم‌های متافازی
• قابلیت شناسایی هم‌زمان تعداد زیادی از حذف‌ها و افزایش‌های تعداد کپی در سراسر ژنوم
• امکان استفاده از آرایه‌های هدفمند برای بررسی دقیق‌تر نواحی ژنومی خاص

محدودیت‌های Array-CGH

• توانایی شناسایی جابه‌جایی‌ها و وارونگی‌های متعادل را ندارد، زیرا در این تغییرات معمولاً افزایش یا کاهش خالصی در مقدار DNA ایجاد نمی‌شود.
• برای شناسایی برخی انواع تغییرات ژنتیکی، مانند جهش‌های تک‌نوکلئوتیدی، روش مناسبی نیست.
• در برخی موارد، تشخیص موزاییک با درصد پایین ممکن است محدود باشد و به میزان موزاییک، نوع نمونه و طراحی آرایه بستگی دارد.
• تفسیر برخی CNVها، به‌ویژه واریانت‌هایی با اهمیت بالینی نامشخص، به پایگاه‌های داده و تخصص بالینی و ژنتیکی نیاز دارد.
• در صورت مشاهده یک ناهنجاری، ممکن است برای تعیین دقیق ساختار تغییر یا تأیید یافته، استفاده از روش‌های تکمیلی مانند FISH، کاریوتایپ یا روش‌های مولکولی ضروری باشد.

تفاوت Array-CGH و SNP-array

Array-CGH و SNP-array هر دو برای بررسی گسترده ژنوم و شناسایی تغییرات تعداد کپی (CNV) به کار می‌روند، اما قابلیت‌های آن‌ها یکسان نیست. SNP-array علاوه بر اطلاعات مربوط به تعداد کپی، اطلاعات ژنوتیپی مربوط به جایگاه‌های SNP را نیز ارائه می‌دهد. به همین دلیل، این روش می‌تواند برخی تغییرات ژنومی بدون تغییر در تعداد کپی، از جمله از دست رفتن هتروزیگوسیتی بدون تغییر تعداد کپی (Copy-neutral Loss of Heterozygosity – CN-LOH) را شناسایی کند.

این یافته‌ها در برخی شرایط می‌توانند با ایزودی‌زومی تک‌والدی (Uniparental Isodisomy – UPD) مرتبط باشند؛ قابلیتی که در aCGH معمولی وجود ندارد. بنابراین، SNP-array در برخی اختلالات ژنتیکی و بیماری‌های توموری می‌تواند اطلاعاتی فراتر از تغییرات تعداد کپی در اختیار متخصص قرار دهد.

استفاده از SNP-array

SNP-array یکی از روش‌های آرایه‌ای ژنومیک است که علاوه بر بررسی تغییرات تعداد کپی، اطلاعات ژنوتیپی مربوط به SNPها را نیز فراهم می‌کند. این ویژگی باعث می‌شود SNP-array در شناسایی برخی تغییرات ژنومی که با افزایش یا کاهش تعداد کپی همراه نیستند نیز کاربرد داشته باشد.

یکی از کاربردهای مهم SNP-array، شناسایی از دست رفتن هتروزیگوسیتی بدون تغییر تعداد کپی (CN-LOH) است. این تغییرات می‌توانند در برخی اختلالات ژنتیکی و بیماری‌های توموری اهمیت داشته باشند و در برخی موارد با ایزودی‌زومی تک‌والدی مرتبط باشند. به همین دلیل، SNP-array در بررسی برخی اختلالات ژنومی و مطالعات سرطان کاربرد دارد.

در مقایسه با aCGH، SNP-array اطلاعات ژنوتیپی بیشتری در اختیار قرار می‌دهد؛ بنابراین انتخاب بین این دو روش باید بر اساس نوع ناهنجاری مورد انتظار، ویژگی نمونه و هدف آزمایش انجام شود.

جمع‌بندی CGH، Array-CGH و SNP-array

CGH، Array-CGH و SNP-array از روش‌های مهم برای بررسی تغییرات ژنومی هستند، اما قابلیت‌های آن‌ها یکسان نیست. CGH سنتی یک روش سیتوژنتیک مولکولی برای شناسایی افزایش و کاهش ماده ژنتیکی در سطح کروموزوم‌هاست، در حالی که Array-CGH با استفاده از آرایه‌های متراکم DNA، امکان شناسایی بسیاری ازتغییرات زیرمیکروسکوپی در تعداد کپی DNA (CNV) را با وضوح بالاتر فراهم می‌کند. SNP-array علاوه بر بررسی تغییرات تعداد کپی، اطلاعات ژنوتیپی ارائه می‌دهد و می‌تواند برخی تغییرات مانند CN-LOH و برخی موارد ایزودی‌زومی تک‌والدی را نیز شناسایی کند.

هیچ‌یک از این روش‌ها برای شناسایی همه انواع ناهنجاری‌های ژنومی مناسب نیستند. برای مثال، Array-CGH و SNP-array معمولاً جابه‌جایی‌ها و وارونگی‌های متعادل را شناسایی نمی‌کنند، در حالی که کاریوتایپ می‌تواند برخی از این تغییرات را نشان دهد. بنابراین، انتخاب روش باید بر اساس نوع تغییر مورد انتظار، ویژگی نمونه و هدف آزمایش انجام شود و در برخی شرایط ممکن است استفاده از روش‌های تکمیلی مانند کاریوتایپ، FISH یا توالی‌یابی برای تأیید یا تکمیل یافته‌ها ضروری باشد.

۵. توالی‌ یابی نسل جدید (Next-Generation Sequencing – NGS)

توالی‌ یابی نسل جدید (Next-Generation Sequencing – NGS) یا Massively Parallel Sequencing یکی از فناوری‌های پیشرفته ژنتیک مولکولی و ژنومیک است که امکان بررسی هم‌زمان تعداد بسیار زیادی از توالی‌های DNA را فراهم می‌کند. برخلاف کاریوتایپ، FISH و سایر روش‌های سیتوژنتیک که عمدتاً برای بررسی تعداد، ساختار یا موقعیت کروموزوم‌ها به کار می‌روند، NGS مستقیماً توالی DNA را بررسی می‌کند.

به همین دلیل، NGS را نباید به‌عنوان یک تکنیک سیتوژنتیک کلاسیک در نظر گرفت؛ بلکه این فناوری در بسیاری از آزمایش‌های ژنتیکی به‌عنوان یک روش مکمل برای شناسایی تغییرات در سطح ژن و ژنوم استفاده می‌شود. بسته به طراحی آزمایش، NGS می‌تواند برای شناسایی برخی واریانت‌های تک‌نوکلئوتیدی (SNV)، تغییرات کوچک حذف و درج (Indel)، برخی تغییرات تعداد کپی (CNV) و در برخی پلتفرم‌ها و روش‌های تحلیلی، تعدادی از تغییرات ساختاری (Structural Variants) مورد استفاده قرار گیرد.

مکانیسم عملکرد NGS

در روش‌های NGS، DNA ابتدا به قطعات مناسب برای توالی‌یابی تبدیل می‌شود و پس از آماده‌سازی کتابخانه (Library Preparation)، قطعات DNA روی سطح یا ساختارهایی که برای تکثیر و خوانش توالی طراحی شده‌اند، قرار می‌گیرند. سپس تعداد بسیار زیادی از قطعات DNA به‌صورت موازی توالی‌یابی می‌شوند.

داده‌های حاصل از این فرآیند به‌صورت مجموعه‌ای از توالی‌های کوتاه یا Reads تولید می‌شوند. این خوانش‌ها با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی به توالی مرجع ژنوم نگاشت یا در برخی روش‌ها مونتاژ می‌شوند و سپس برای شناسایی واریانت‌های ژنتیکی مورد تحلیل قرار می‌گیرند.

عمق توالی‌یابی (Sequencing Depth یا Coverage) نشان می‌دهد که هر ناحیه از DNA چند بار خوانده شده است. افزایش عمق توالی‌یابی در بسیاری از آزمایش‌ها می‌تواند به افزایش اطمینان در شناسایی برخی واریانت‌ها کمک کند، اما مقدار عمق مورد نیاز به نوع آزمایش و هدف تشخیصی بستگی دارد.

رویکردهای اصلی NGS

NGS را می‌توان با توجه به هدف آزمایش در مقیاس‌های مختلف انجام داد:

• Whole Genome Sequencing (WGS): بررسی تقریباً کل ژنوم و امکان شناسایی طیف گسترده‌ای از واریانت‌های ژنتیکی، با توجه به نوع آزمایش و قابلیت تحلیلی پلتفرم مورد استفاده
• Whole Exome Sequencing (WES): بررسی بخش‌های کدکننده ژن‌ها یا اگزوم که بخش کوچکی از کل ژنوم را تشکیل می‌دهد و در بسیاری از بیماری‌های ژنتیکی دارای اهمیت بالینی است.
• Targeted Gene Panels: بررسی مجموعه مشخصی از ژن‌ها یا نواحی ژنومی مرتبط با یک بیماری یا گروهی از بیماری‌ها؛ این روش معمولاً حجم داده کمتر و تمرکز تحلیلی بیشتری نسبت به WES و WGS دارد.

انتخاب بین WGS، WES و پنل‌های هدفمند به هدف آزمایش، نوع بیماری یا ناهنجاری مورد انتظار، تعداد ژن‌های مرتبط و الزامات بالینی بستگی دارد.

کاربردهای NGS در بررسی اختلالات ژنتیکی

NGS در حوزه‌های مختلف ژنتیک و پزشکی کاربرد دارد، از جمله:

• شناسایی واریانت‌های تک‌نوکلئوتیدی (SNV) و تغییرات کوچک حذف و درج (Indel)
• بررسی ژن‌های مرتبط با بیماری‌های ارثی در قالب پنل‌های هدفمند یا WES
• بررسی گسترده‌تر تغییرات ژنتیکی با استفاده از WGS
• شناسایی برخی CNVها و تغییرات ساختاری، در صورتی که روش توالی‌یابی و خط لوله تحلیلی مورد استفاده برای شناسایی آن‌ها طراحی شده باشد
• بررسی تغییرات ژنتیکی مرتبط با برخی سرطان‌ها و کمک به انتخاب یا ارزیابی برخی درمان‌های هدفمند
• استفاده در تحقیقات ژنتیکی، مطالعات ژنوم و پزشکی شخصی‌سازی‌شده

در تشخیص پیش از تولد نیز روش‌های مبتنی بر توالی‌یابی گسترده موازی می‌توانند در آزمایش غربالگری غیرتهاجمی پیش از تولد (NIPT) برای بررسی خطر برخی آنیوپلوئیدی‌های شایع مورد استفاده قرار گیرند. با این حال، NIPT یک آزمایش غربالگری است و نتیجه مثبت آن معمولاً به ارزیابی و در صورت نیاز تأیید با آزمایش تشخیصی نیاز دارد.

مزایای NGS

• امکان بررسی هم‌زمان تعداد بسیار زیادی از نواحی ژنومی
• توانایی شناسایی طیف گسترده‌ای از واریانت‌ها، به‌ویژه SNVها و Indelهای کوچک
• امکان استفاده از پنل‌های هدفمند، WES یا WGS متناسب با هدف آزمایش
• قابلیت پردازش تعداد زیادی نمونه در برخی طراحی‌های آزمایشگاهی
• کاربرد گسترده در تحقیقات ژنتیکی، تشخیص بیماری‌های ارثی، انکولوژی و پزشکی شخصی‌سازی‌شده

محدودیت‌های NGS

• هزینه تجهیزات، زیرساخت، آماده‌سازی نمونه و تحلیل داده‌ها می‌تواند بالا باشد.
• تفسیر داده‌های NGS به دانش تخصصی در ژنتیک، بیوانفورماتیک و تفسیر واریانت‌ها نیاز دارد.
• توانایی NGS در شناسایی یک نوع خاص از تغییر ژنومی به پلتفرم، طراحی آزمایش، عمق توالی‌یابی و روش تحلیل داده‌ها وابسته است.
• همه تغییرات ساختاری یا تغییرات تعداد کپی با دقت یکسان توسط همه روش‌های NGS قابل شناسایی نیستند.
• برخی یافته‌ها ممکن است از نظر بالینی اهمیت نامشخص داشته باشند و نیازمند بررسی پایگاه‌های داده، شواهد علمی و ارزیابی تخصصی باشند.
• در برخی موارد، برای تأیید یک یافته یا تعیین دقیق ساختار یک ناهنجاری، استفاده از روش‌های مکمل مانند Sanger sequencing، FISH، کاریوتایپ یا سایر روش‌های مولکولی و ژنومی ضروری است.

جایگاه NGS در کنار تکنیک‌های سیتوژنتیک

NGS و تکنیک‌های سیتوژنتیک را نمی‌توان کاملاً جایگزین یکدیگر دانست؛ زیرا هر روش برای شناسایی گروه خاصی از تغییرات ژنتیکی و کروموزومی مناسب‌تر است. کاریوتایپ برای بررسی تعداد و ساختار کلی کروموزوم‌ها و برخی ناهنجاری‌های بزرگ و متعادل ارزشمند است، FISH برای بررسی تغییرات هدفمند کاربرد دارد و روش‌های آرایه‌ای مانند Array-CGH برای شناسایی بسیاری از CNVهای زیرمیکروسکوپی مناسب هستند. در مقابل، NGS برای بررسی توالی DNA و شناسایی طیف گسترده‌ای از واریانت‌های مولکولی، بسته به نوع آزمایش، مزیت دارد.

بنابراین، انتخاب NGS یا سایر روش‌های ژنتیکی باید بر اساس نوع ناهنجاری مورد انتظار، ویژگی نمونه، هدف آزمایش و اطلاعات بالینی انجام شود. در بسیاری از موارد، ترکیب چند روش می‌تواند تصویر جامع‌تری از وضعیت ژنتیکی یا کروموزومی نمونه ارائه دهد.

انتخاب تکنیک مناسب برای بررسی ناهنجاری‌های کروموزومی و ژنومی

انتخاب روش مناسب برای بررسی ناهنجاری‌های کروموزومی و ژنومی به عوامل مختلفی از جمله نوع تغییر مورد انتظار، اندازه و ماهیت ناهنجاری، ویژگی نمونه، هدف آزمایش و اطلاعات بالینی بستگی دارد. هیچ روش واحدی نمی‌تواند همه انواع تغییرات ژنتیکی و کروموزومی را با یک میزان دقت شناسایی کند؛ بنابراین در برخی شرایط، استفاده از یک روش منفرد و در برخی موارد، ترکیب چند روش می‌تواند مناسب‌تر باشد.

کاریوتایپ

این روش برای بررسی تعداد کروموزوم‌ها و شناسایی بسیاری از ناهنجاری‌های عددی و ساختاری نسبتاً بزرگ، از جمله برخی جابه‌جایی‌ها و وارونگی‌های متعادل، کاربرد دارد. این روش در شرایطی مانند بررسی برخی اختلالات کروموزومی، برخی موارد ناباروری و سقط مکرر و ارزیابی بعضی ناهنجاری‌های کروموزومی در سرطان‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

FISH

تکنیک FISH زمانی گزینه مناسبی است که یک ناهنجاری یا ناحیه ژنومی مشخص مورد نظر باشد. این روش می‌تواند برای تأیید یا بررسی هدفمند برخی حذف‌ها، افزایش‌های تعداد کپی، جابه‌جایی‌ها و فیوژن‌های ژنی استفاده شود و در بسیاری از کاربردها امکان بررسی هسته‌های اینترفازی را فراهم می‌کند. با این حال، به دلیل وابستگی به پروب اختصاصی، برای بررسی جامع و بدون هدف کل ژنوم مناسب نیست.

در مواردی که هدف، شناسایی تغییرات تعداد کپی (CNV) در گستره وسیعی از ژنوم باشد، روش‌های آرایه‌ای مانند Array-CGH و SNP-array می‌توانند نسبت به کاریوتایپ وضوح بالاتری ارائه دهند. این روش‌ها در بررسی برخی اختلالات رشدی، ناهنجاری‌های مادرزادی و بیماری‌های ژنتیکی کاربرد دارند. SNP-array علاوه بر اطلاعات مربوط به تعداد کپی، اطلاعات ژنوتیپی نیز ارائه می‌دهد و می‌تواند در شناسایی برخی تغییرات مانند CN-LOH و برخی موارد ایزودی‌زومی تک‌والدی (UPD) مفید باشد.

QF-PCR

این روش بیشتر برای تشخیص سریع و هدفمند برخی آنیوپلوئیدی‌های شایع، به‌ویژه تریزومی‌های کروموزوم‌های ۱۳، ۱۸ و ۲۱ و برخی اختلالات کروموزوم‌های جنسی، مورد استفاده قرار می‌گیرد. سرعت بالای این روش و عدم نیاز به کشت سلولی باعث شده است که در برخی آزمایش‌های پیش از تولد کاربرد داشته باشد؛ با این حال، QF-PCR برای بررسی جامع ساختار و توالی ژنوم طراحی نشده است.

NGS

روش NGS یک فناوری ژنتیک مولکولی و ژنومیک است و برخلاف کاریوتایپ و FISH، مستقیماً توالی DNA را بررسی می‌کند. بسته به نوع آزمایش، مانند پنل‌های هدفمند، WES یا WGS، می‌توان از NGS برای شناسایی انواع مختلفی از واریانت‌ها، از جمله SNVها و Indelهای کوچک و در برخی طراحی‌ها CNVها و تغییرات ساختاری، استفاده کرد. بنابراین، انتخاب NGS باید بر اساس نوع واریانت مورد انتظار و قابلیت‌های روش و پلتفرم مورد استفاده انجام شود.

راهنمای کلی انتخاب روش

به‌صورت کلی می‌توان انتخاب روش را بر اساس نوع سؤال آزمایش به شکل زیر در نظر گرفت:

هدف یا نوع ناهنجاری	روش مناسب‌تر
بررسی تعداد کروموزوم‌ها و ناهنجاری‌های بزرگ ساختاری	کاریوتایپ
بررسی هدفمند یک ژن یا ناحیه کروموزومی مشخص	FISH
تشخیص سریع برخی آنیوپلوئیدی‌های شایع	QF-PCR
بررسی گسترده CNVهای زیرمیکروسکوپی	Array-CGH
بررسی CNV همراه با اطلاعات ژنوتیپی و برخی CN-LOH یا UPD	SNP-array
بررسی SNV، Indel و سایر واریانت‌های توالی، بسته به طراحی آزمایش	NGS
بررسی هم‌زمان چند نوع ناهنجاری	ترکیب روش‌ها بر اساس سؤال بالینی و آزمایشگاهی

در برخی شرایط، یک روش به‌تنهایی برای رسیدن به تشخیص کافی نیست. برای مثال، ممکن است یک ناهنجاری ابتدا با کاریوتایپ یا Array-CGH شناسایی شود و سپس برای تعیین دقیق‌تر یا تأیید آن از FISH یا یک روش مولکولی استفاده شود. همچنین در مواردی که احتمال یک بیماری ناشی از تغییرات توالی DNA وجود دارد، استفاده از NGS می‌تواند اطلاعاتی فراهم کند که با روش‌های سیتوژنتیک یا آرایه‌ای به دست نمی‌آید.

بنابراین، بهترین تکنیک لزوماً پیشرفته‌ترین یا گران‌ترین تکنیک نیست؛ بلکه روشی است که بیشترین تناسب را با نوع ناهنجاری مورد انتظار، ویژگی نمونه و هدف آزمایش داشته باشد. در آزمایشگاه‌های تخصصی نیز انتخاب روش می‌تواند بر اساس ترکیبی از روش‌های سیتوژنتیک، آرایه‌ای و ژنتیک مولکولی انجام شود تا احتمال شناسایی و تفسیر صحیح ناهنجاری افزایش یابد.

ابزارها و تجهیزات سیتوژنتیک پارس‌ژن

اجرای دقیق آزمایش‌ها و تحلیل‌های سیتوژنتیک به تجهیزات مناسب برای آماده‌سازی نمونه، تصویربرداری، مشاهده و تحلیل نتایج نیاز دارد. پارس‌ژن با ارائه مجموعه‌ای از تجهیزات و راهکارهای تخصصی آزمایشگاهی، نیازهای مختلف آزمایشگاه‌های ژنتیک و سیتوژنتیک را پوشش می‌دهد.

در فرآیندهای سیتوژنتیک، تجهیزاتی مانند میکروسکوپ‌های تخصصی، سیستم‌های تصویربرداری و نرم‌افزارهای تحلیل و آنالیز تصویر می‌توانند برای مشاهده و ارزیابی کروموزوم‌ها، تحلیل تصاویر کاریوتایپ و بررسی سیگنال‌های فلورسنت در روش‌هایی مانند FISH مورد استفاده قرار گیرند. انتخاب تجهیزات مناسب باید بر اساس نوع آزمایش، نوع نمونه، سطح دقت مورد نیاز و روش مورد استفاده در آزمایشگاه انجام شود.

استفاده از سیستم‌های تصویربرداری و تحلیل تخصصی می‌تواند به استانداردسازی فرآیند بررسی تصاویر، کاهش خطای انسانی و افزایش سرعت تحلیل کمک کند. این تجهیزات در کنار روش‌های آزمایشگاهی مناسب، زیرساخت لازم برای انجام و تفسیر بخشی از آزمایش‌های سیتوژنتیک و ژنومیک را فراهم می‌کنند.

تجهیزات سیتوژنتیک و ژنتیک پارس‌ژن

برای آشنایی با تجهیزات مرتبط با سیتوژنتیک، تصویربرداری میکروسکوپی و تحلیل تصاویر آزمایشگاهی و بررسی مشخصات فنی هر محصول، می‌توانید مجموعه محصولات پارس‌ژن را مشاهده کنید. انتخاب تجهیزات مناسب با توجه به کاربرد آزمایشگاهی، نوع نمونه و تکنیک مورد استفاده، نقش مهمی در ایجاد یک فرآیند دقیق و قابل اعتماد دارد.ه محصولات ما مراجعه کنید.