هدف TruResolution وضوح حداکثری در تصویربرداری عمیق است
اهداف TruResolution دارای یک سیستم جبران انحراف کروی خودکار است که برای مشاهده عمیق طراحی شده است
اهداف TruResolution که برای استفاده با میکروسکوپ اسکن لیزری چند فوتونی Olympus FVMPE-RS طراحی شده است، مجهز به یک سیستم یقه تصحیح کنترل شده توسط کامپیوتر است که میتواند به طور خودکار تنظیم شود تا انحراف کروی را در هنگام مشاهده عمیق نمونه های ضخیم جبران کند. هنگام تصویربرداری از عمق نمونه با استفاده از میکروسکوپ چند فوتونی، انحراف کروی شدت و وضوح فلورسانس را کاهش میدهد.
یک یقه اصلاح عینی میتواند به کاهش این مشکل کمک کند. با این حال، یقه های تصحیح دستی میتواند دست و پا گیر باشد. با سیستم TruResolution، نرم افزار اختصاصی یک یقه اصلاح موتوری را با استفاده از الگوریتم منحصر به فرد Olympus هدایت میکند و تنظیم بهینه یقه را در هر عمق، به سرعت و با دقت تعیین میکند. مخصوصاً برای گرفتن تصویر پشته Z عمیق، یقه تصحیح به طور خودکار تنظیم میشود که شما به تدریج عمیقتر در نمونه مشاهده میکنید. در نتیجه، عملکرد اهداف TruResolution را میتوان در تمام اعماق به حداکثر رساند تا تصاویر روشن و با وضوح بالا به دست آید.
انحراف کروی و نقش یقه های اصلاحی
اهداف میکروسکوپ بر طراحی دقیق و فرآیندهای ساخت دقیق تکیه دارند تا به سطح بالایی از عملکرد نوری لازم برای حل ساختارهای ظریف درون سلولها و اندامکها دست یابند. یک لنز کروی منفرد از نظر فیزیکی در توانایی خود برای تمرکز نور روی نقطه تیز محدود است. بنابراین، اهداف از ترکیب عناصر لنز متعددی طراحی شده‌اند که با دقت انتخاب و در موقعیت قرار گرفته‌اند تا انحرافات نوری فردی را که شکل‌گیری تصویر را مخدوش یا تار، متعادل کنند. با این حال، تغییرات در ضریب شکست به دلیل محیط غوطه‌وری، شیشه‌های پوششی یا خود نمونه میتواند این تعادل را بر هم بزند. پرتوهای نوری که از حاشیه دیافراگم شیئ می‌آیند با زاویه بزرگتری به کانون نزدیک میشوند و بنابراین در یک رابط نسبت به پرتوهایی که از مرکز شی می‌آیند، شکست بیشتری را تجربه میکنند. این منجر به انحراف کروی میشود، جایی که موقعیت فوکوس در عمق بین پرتوهای نور مرکزی و محیطی متفاوت است و به صورت وضوح کمتر و شدت فلورسانس در میکروسکوپ ظاهر میشود.
اهداف را میتوان برای جبران انحراف کروی طراحی کرد، اما مقدار مناسب تصحیح با شرایط مشاهده متفاوت خواهد بود. یک یقه اصلاح قابل تنظیم انعطاف پذیری لازم برای حفظ عملکرد تصویربرداری در طیف وسیعی از شرایط را فراهم میکند. به عنوان مثال، زمانی که میکروسکوپ در آب متمرکز است و هیچ تغییری در ضریب شکست وجود ندارد، یک هدف غوطه‌ور شدن آب با یقه اصلاح روی 0 تنظیم میشود (شکل 1(a)). با این حال، هنگامی که سطح یک نمونه بافت از طریق یک لغزش پوشش شیشه ای مشاهده میشود، ضریب شکست به دلیل ایجاد انحراف کروی که باعث تخریب کانون میشود، توسط لایه شیشه تغییر میکند (شکل 1(b)). این انحراف کروی را میتوان با پیش بردن یقه اصلاحی برای تنظیم مجدد نقاط کانونی پرتوهای نور جبران کرد (شکل 1(c)). اگر صفحه کانونی به عمق نمونه منتقل شود، انحراف کروی بیشتری ایجاد میشود و تنظیم یقه قبلی دیگر برای حفظ فوکوس واضح کافی نیست (شکل 1(d)). تنظیم باید بیشتر تنظیم شود. با میکروسکوپهای چند فوتونی، عمق مشاهده میتواند از چند صد میکرومتر تا چندین میلیمتر برسد و تصحیح انحراف کروی برای حفظ وضوح تصویر و کنتراست بالا حیاتی تر میشود.
شکل 1: شکلهای شماتیک انحراف کروی ناشی از شیشه پوشش یا بافت و اثر تنظیم یقه اصلاح.
(a) نقطه فوکوس ایده‌آل: هنگامیکه از یک هدف غوطه‌ور در آب برای مشاهده یک شی در آب استفاده میشود، تمرکز نور محوری و نور خارج از محور در یک نقطه است. هیچ اثر انحراف کروی وجود ندارد.
(b) نقطه کانونی با انحراف کروی – هنگامیکه سطح بافت در زیر شیشه پوششی با غوطه وری در آب مشاهده میشود، شکست در هر دو سطح شیشه پوشش اتفاق میافتد که باعث انحراف کروی میشود.
(c) انحراف کروی با تنظیم یقه اصلاح جبران میشود.
(d) در حالی که یقه اصلاح هنوز در شکل 1(c) تنظیم شده است، زمانیکه موقعیت فوکوس به موقعیت عمیقتری در نمونه منتقل میشود، انحراف کروی دوباره رخ میدهد.
جبران خودکار انحراف کروی با سیستم TruResolution
در میکروسکوپ اسکن لیزری چند فوتونی، وضوح تصویر و کنتراست تصویر به شدت به اندازه نقطه کانونی بستگی دارد. فوکوس کوچکتر و فشرده تر مستقیماً به وضوح بالاتر ترجمه میشود. اما همچنین منجر به چگالی نور بالاتر و تحریک چند فوتونی کارآمدتر میشود. بنابراین، شدت فلورسنت بالاتر برای همان توان کل لیزر ارائه میشود. تنظیم مناسب یقه اصلاح شی به حداقل رساندن انحراف کروی برای حفظ یک نقطه کانونی تیز کمک میکند. با این حال، موقعیت بهینه یقه اصلاح بسته به ضریب شکست نمونه، ضخامت شیشه پوشش و عمق صفحه مشاهده متفاوت است. گاهی اوقات لازم است که یقه اصلاح را چندین بار در حین گرفتن تصاویر تنظیم کنید.
تنظیم یقه تصحیح دستی در طول گرفتن تصویر میتواند مشکل ساز باشد. زیرا هر تنظیم سطح کانونی را کمی تغییر میدهد (شکل 2(a)). بعلاوه، میکروسکوپ چند فوتونی اغلب در یک محیط تاریکخانه انجام میشود و مشکل کارکردن دستی یقه اصلاح را تشدید میکند. این مسائل بهینه سازی تنظیمات یقه را در حین گرفتن تصویر حجمی بسیار چالش برانگیز میکند. اکثر میکروسکوپهای چند فوتونی باید در موقعیت یقه میانی قرار گیرند، که در یک صفحه از پشته Z مناسب است. اما در بسیاری از سطوح دیگر کمتر از حد مطلوب است.
این سیستم مشکلات را با یک ترفند یقه اصلاح موتوری کنترل شده توسط کامپیوتر حل میکند. فعال کردن یقه بطور خودکار با موتور فوکوس میکروسکوپ هماهنگ میشود و موقعیت Z هدف را تنظیم میکند تا صفحه کانونی ثابتی را حتی زمانیکه یقه اصلاح میچرخد، حفظ کند (شکل 2(a)). کنترل از راه دور از طریق نرم افزار نه تنها عملکرد مستقیم کاربر را ساده میکند، بلکه تنظیم خودکار یقه را در هر هواپیما در حین کسب Z-stack امکان پذیر میکند. تصاویر سه بعدی را میتوان با وضوح و کنتراست بهبود یافته، به ویژه در هنگام مشاهده عمیق، بدست آورد.
سیستم TruResolution از یک الگوریتم سفارشی استفاده میکند، که موقعیت بهینه یقه تصحیح را بر اساس منحنی کنتراست به دست آمده از تصاویر بدست آمده در تنظیمات یقه مختلف تعیین میکند (شکل 2(b)). کاربر میتواند این جستجو را به صورت خودکار با یک کلیک در نرم افزار اختصاصی انجام دهد. علاوه بر این، با یافتن و ذخیره بهترین موقعیت یقه اصلاح در هر صفحه، سیستم TruResolution میتواند یقه اصلاح را به طور خودکار در طول یک اسکن حجم صدا هدایت کند. این عملکرد نوآورانه بدست آوردن تصاویر پیوسته روشن و با وضوح بالا در هر عمق را ساده میکند.
شکل 2
(a) هنگامیکه یقه های اهداف معمولی چرخانده میشوند، صفحه کانونی نیز تغییر میکند (چپ). اهداف TruResolution صفحه کانونی را با تغییر خودکار موقعیت Z هدف با توجه به زاویه چرخش (راست) حفظ میکنند.
(b) یافتن زاویه یقه تصحیح بهینه (θopt): یک منحنی با محاسبه مقدار کنتراست هر تصویر به دست آمده در زوایای یقه اصلاحی مختلف تعیین میشود. موقعیت بهینه یقه اصلاح با تعیین اوج این منحنی کنتراست محاسبه میشود.
برنامه های تصویربرداری عمیق
شکل 3 قابلیت های تصویربرداری عمیق قدرتمند اهداف TruResolution را با استفاده از مهره های فلورسنت تعبیه شده در ژل با ضریب شکست و ضریب پراکندگی نور مشابه مغز موش زنده نشان میدهد. ردیف پایین تصاویر، تخریب تدریجی نقطه کانونی را نشان میدهد، زیرا ناحیه مشاهده از بالای نمونه، تا عمق 800 میلیمتر، بدون تنظیم یقه اصلاح، پیش میرود. قابل توجه لکه دار شدن تصاویر در امتداد محور z و کاهش شدت پیک با عمق است. در مقابل، تنظیم خودکار یقه با استفاده از سیستم TruResolution، نقطه کانونی فشرده تری را در اعماق مختلف ارائه میدهد. ردیف بالای تصاویر به وضوح نشان میدهد که چگونه سیستم روشنایی و وضوح تصویر را در طول تصویربرداری عمیق بهبود میبخشد.
شکل 3
میکروبیدهای فلورسنت (قطر = 200 نانومتر) در ژل با ویژگی نوری مشابه مغز موش زنده (ضریب شکست: 1.36، ضریب پراکندگی نور: 43 سانتی‌متر-1) در 960 نانومتر با توان لیزر ثابت که برای همه تصاویر استفاده میشود.
(ردیف بالایی) تصاویر Microbead XZ در اعماق مختلف با استفاده از جبران انحراف کروی خودکار TruResolution به دست آمده اند.
(ردیف پایین) تصاویر Microbead XZ در اعماق مختلف با استفاده از یک یقه اصلاح ثابت که در ابتدا برای تصویربرداری بهینه از سطح ژل تنظیم شده بود، به دست آمد.
مقیاسهای روشنایی تصویر در هر عمق نرمال میشوند. تمام تصاویر با هدف FV30-AC25W به دست آمدند.
شکل 4 کاربرد عملی TruResolution را برای مشاهده in vivo دندریتهای عصبی در مغز موش زنده نشان میدهد. این تصاویر 400 میکرومتر زیر سطح مغز با استفاده از هدف FV30-AC25W TruResolution (بزرگنمایی 25 برابر، دیافراگم عددی 1.05، فاصله کاری 2 میلی متر) به دست آمد. جبران انحراف کروی TruResolution تصویر بسیار روشنتری نسبت به تصویری که با استفاده از یقه اصلاح ثابت به دست می‌آید ارائه میدهد. مهم‌تر از آن، مورفولوژی ساختاری ویژگیهای زیر میکرونی مانند سر و گردن ستون فقرات دندریتیک، هنگام استفاده از TruResolution به وضوح بیشتری به تصویر کشیده میشوند.
شکل 4: مشاهده in vivo دندریت عصبی در مغز موش زنده (موش Thy1-YFP-H، قشر حسی) که در عمق 400 میکرومتر، با تحریک در 960 نانومتر به دست آمد.
(تصویر بالا) جبران انحراف کروی خودکار توسط شیئی FV30-AC25W TruResolution، تصاویر واضح و با کنتراست بالا از خارهای دندریتی به دست میدهد.
(تصویر پایین) برای مقایسه، همان میدان دید با یقه اصلاح بهینه شده برای سطح نمونه گرفته شد – همانطور که در یقه های اصلاح معمولی معمول است.
سیستم TruResolution با نمونه های بافت پاک شده نیز موثر است. ضریب شکست بین روشهای مختلف پاکسازی بافت بسیار متفاوت است و حتی ممکن است بین کاربردهای یک تکنیک متفاوت باشد. توجه به موقعیت یقه تصحیح برای ثبت تصاویر با کیفیت بالا و مداوم در سراسر حجمهای بزرگ که معمولاً در بافت پاک شده گرفته میشود، حیاتی است. هدف FV30-AC10SV TruResolution (بزرگنمایی 10 برابر، دیافراگم عددی 0.6، فاصله کاری 8 میلیمتر) برای انطباق ضرایب انکسار از 1.33 تا 1.52 طراحی شده است و طیف وسیعی از روشهای پاکسازی بافت را پشتیبانی میکند. شکل 5 تصاویر به دست آمده از مغز موش را نشان میدهد که با استفاده از ScaleA2 پاک شده است. TruResolution برای تعیین خودکار تنظیمات بهینه یقه استفاده شد و تصاویر واضحی با کنتراست روشن در سرتاسر حجم صدا ایجاد کرد، به خصوص در مقایسه با تصاویری که با موقعیت یقه دلخواه گرفته شده بودند. شکل 5 (b) نمونه ای از بهبود قابل توجه در وضوح تصویر و روشنایی ممکن است زمانی که TruResolution برای به حداقل رساندن انحرافات کروی استفاده میشود.
شکل 5: مغز موش (موس Thy1-YFP-H) با ScaleA2 پاک شد.
(a) تصویر XZ از پشته 4 میلیمتری Z: تصویر سمت چپ توسط سیستم TruResolution به دست آمده است. تصویر سمت راست با استفاده از موقعیت یقه اصلاح دلخواه بدست آمد.
(b) حداکثر نمایش تصاویر XY از ضخامت 100 میکرومتر در عمق 2.7 میلیمتر: تصویر سمت چپ توسط سیستم TruResolution به دست آمده است. تصویر سمت راست با استفاده از موقعیت یقه اصلاح دلخواه بدست آمد.
تمام تصاویر با تحریک 960 نانومتری با همان توان لیزر و با استفاده از هدف FV30-AC10SV به دست آمده‌اند.
خلاصه
این نتایج تصویربرداری عمیق نشان میدهد که چگونه کنترل خودکار کامپیوتری یک یقه اصلاحی موتوری میتواند تصویربرداری چند فوتونی را تحت شرایط مشاهده چالش‌برانگیز مختلف بهبود بخشد. اهداف TruResolution با به حداقل رساندن انحراف کروی در میکروسکوپ چند فوتونی، امکان ثبت تصاویر سه بعدی روشن و با وضوح بالا را فراهم میکند.
| FV30-AC10SV | FV30-AC25W | |
|---|---|---|
| بزرگنماییها | 10 | 25 |
| NA | 0.6 | 1.05 |
| W.D. | 8mm | 2mm |
| ضخامت شیشه پوشش | 0mm-0.23mm | 0mm - 0.23mm |
| مایع غوطه وری | Scaleview-A2 (آب، روغن سیلیکون و روغن معمولی) | آب |
| ویژگیهای خاص | جبران خودکار، بهینه سازی شده برای تصویربرداری چند فوتونی | جبران خودکار، بهینه سازی شده برای تصویربرداری چند فوتونی |
| ابعاد | 56mm x 106.5mm x 95mm | 56mm x 106.5mm x 101mm |
| وزن | تقریبا 1 کیلوگرم | تقریبا 1 کیلوگرم |
