فلورسنت
فلورسنت (Fluorescence) یک پدیده فیزیکی است و زمانی اتفاق میافتد که یک ماده برای مدت کوتاهی با یک نور برخورد کرده، انرژی این نور را به صورت فوتون (کوانتوم‌های انرژی) جذب میکند و سپس بخشی از این انرژی نورانی را با طول موج بلندتر به شکل فلورسنت از خود ساطع میکند. این پدیده در بسیاری از مواد شیمیایی و فیزیکی به وضوح مشاهده میشود و میتوان از آن برای انجام آزمایشهای مختلف و همچنین در دستگاه‌ها و وسایل الکترونیکی استفاده کرد.
تعریف تابش فلورسنت
این تابش، به عنوان یک تابش الکترومغناطیس شناخته میشود. فلورسنت گسیل نور مرئی توسط اتم ها در موادی است که توسط انرژی ناشی از تشعشعات فرودی یا ذرات، برانگیخته شده اند. این انتشار خیلی سریع، در عرض 10-8 ثانیه، پس از برانگیختن اتم‌ها اتفاق میافتد.
تحریک اولیه معمولاً ناشی از جذب انرژی از تابش یا ذرات ورودی مانند پرتو ایکس یا الکترون است. از آنجا که بازتاب انرژی به سرعت اتفاق میافتد، فلورسنت به محض حذف منبع تحریک کننده متوقف میشود. بر خلاف فسفرسنت که پس از حذف منبع تحریک به انتشار نور ادامه میدهد.
یک لامپ فلورسنت دارای پوششی داخلی است که از پودر و گاز تشکیل شده است. هنگامیکه الکتریسیته از گاز عبور میکند، اشعه ماورا بنفش تولید میکند که پودر را فعال کرده و باعث میشود تا نور ساطع کند.
همانطور که در بالا نیز اشاره شد، فلورسنت پدیده ای است که در آن برخی از مواد وقتی در معرض نوع خاصی از انرژی مانند الکترونها قرار میگیرند، نور ساطع میکنند. در مورد صفحه‌های تلویزیون یا کامپیوتر، پیکسلهای روی صفحه نمایش هنگامی که الکترونهای تفنگ الکترونی به آنها برخورد میکنند، نور ساطع میکنند و باعث درخشش در آنها میشود.
فلورسنت معمولاً برای تجزیه و تحلیل مولکولها و همچنین روشن کردن پارچه ها در نور خورشید استفاده میشود. اشعه ایکس یکی دیگر از کاربردهای فلورسنت است که برای تجزیه و تحلیل مواد معدنی با قرار دادن آنها در معرض اشعه ایکس و مشاهده نور ساطع شده استفاده میشود.
شکل 1. نمایی از لامپ فلورسنت
فرایند فلورسنت چیست؟
فلورسنت یک سیگنال نوری است که زمانی تشخیص داده میشود که یک ترکیب شیمیایی به نام فلوروفور (fluorophore) انرژی را در طول موج خاصی جذب میکند و باعث تحریک آن میشود. سپس فلوروفور در حالیکه انرژی خود را از دست داده و به حالت اولیه خود باز میگردد، نور را با طول موج طولانی تری ساطع میکند.
بطور کلی فلورسنت یک فرآیند سه مرحله‌ای است، همان طور که در شکل 2 توضیح داده شده است. در مرحله اول، فلوروفور در معرض نور الکترومغناطیسی خاص تولید شده توسط لیزر قرار میگیرد و از فیلترهای نوری عبور میکند تا طول موج بسیار خاصی ایجاد کند که با طول موج تحریک مطابقت دارد. این نور انرژی کافی برای حرکت الکترون در مولکول از حالت پایه خود (Gs) به حالت برانگیخته (Es) را فراهم میکند. در مرحله دوم الکترون نور را جذب کرده و وارد حالت برانگیخته میشود.
در مرحله نهایی، الکترون ابتدا انرژی خود را از طریق آرامش ارتعاشی (آرامش ارتعاشی به فرآیندی اطلاق میشود که طی آن یک مولکول ارتعاشی انرژی اضافی را به شکل گرما، نور یا دیگر اشکال انرژی آزاد میکند، زیرا به پایین‌ترین حالت انرژی خود باز میگردد. این آزاد شدن انرژی منجر به دستیابی مولکول به حالت انرژی کمتر و پایداری بیشتر میشود) از دست میدهد تا از حالت الکترونیکی برانگیخته به پایین ترین حالت ارتعاشی برسد.
سپس به پایین ترین سطح انرژی خود یعنی حالت پایه دست مییابد. در طی این فرآیند، انرژی به شکل نور، به ویژه فوتون، با بازگشت الکترون به حالت پایه خود منتشر میشود. مقدار انرژی آزاد شده و طول موج حاصل از این نور ساطع شده به عنوان یک ویژگی منحصر به ماده مورد مطالعه (در این مورد فلوروفور) شناخته میشود و به تعیین رنگ آن و الگوی خاص طول موجهایی که ساطع میکند کمک خواهد کرد که به عنوان طیف انتشار آن شناخته میشود.
جالب اینجاست که طول موج نور ساطع شده معمولاً بیشتر از نور تحریکی است که این فرآیند را آغاز کرده است. این امر به این دلیل رخ میدهد که الکترون در ابتدا مقداری انرژی را به عنوان گرما در طول آرامش ارتعاشی قبل از انتشار نور به عنوان فلورسانس آزاد میکند. تفاوت طول موج بین نور تحریک و نور ساطع شده، جابجایی استوکس (Stokes shift) نامیده میشود.
شکل 2. سه مرحله رویداد نور فلورسنت
شکل 3. جابه جایی استوکس
فلوروفور چیست؟
فلوروفورها (Fluorophores) یا فلوروکروم‌ها (fluorochromes) مواد شیمیایی واکنش دهنده نوری هستند که به شکل قابل پیش‌بینی انرژی را جذب کرده و انتشار میدهند.
هنگامیکه این مواد شیمیایی برانگیخته میشوند، نور ساطع میکنند که این نور ساطع شده برای برچسب گذاری و ردیابی سلولها یا مولکولها، مشاهده و تصویربرداری از پروتئینها و تعیین کمیت و اندازه گیری ترکیبات مختلف مورد استفاده قرار میگیرند.
فلوروفورها انرژی نوری با طول موج خاصی جذب میکنند و آن را با طول موج بلندتری انتشار میدهند. طول موجهایی که در آنها، فلوروفور نور را جذب کرده و منتشر میکنند، به عنوان طیف جذب و انتشار فلوروفور شناخته میشوند که در کنار هم طیف فلورسنت (fluorescence spectra) را تشکیل میدهند (شکل 4). فلوروفورها نور را با شدتهای مختلف ساطع میکنند. روشنایی یک فلوروفور با میزان جذب نور و چگونگی تبدیل موثر نور جذب شده به نور ساطع شده تعیین میشود.
برای استفاده تجاری رنگهای فلورسنت مختلفی در دسترس هستند که میتوانند نور را در طول موجهای خاص در سراسر طیف مرئی، از جمله ناحیه مادون قرمز، جذب و منتشر کنند.
در کار با ابزارهایی مانند میکروسکوپ های فلورسنت و فلوسیتومترها از این رنگها استفاده میشود. این ابزارها، لیزرهایی دارند که نور را در طول موجهای خاص برای تحریک فلوروفورها ساطع میکنند و حسگرهایی برای تشخیص طول موجهای مختلف نور دارند. برخی از ابزارها از چندین لیزر و فیلترهای نوری برای آنالیزهای پیچیده تر استفاده میکنند. حسگرها، نور ساطع شده از فلوروفورها را در نمونه تشخیص میدهند و سیگنال فلورسنت را ارائه میدهند.
فلورسنت در 100 سال گذشته در تحقیقات بیولوژیکی بسیار مورد استفاده قرار گرفته است و همراه با پیشرفت در شیمی فلورسنت، و توسعه فنی ابزارهای مرتبط، بسیاری از انواع مختلف فلوروفورها شناخته شده اند. در حال حاضر، امکان انتخاب گسترده بین فلوروفورها انعطاف پذیری، تنوع و عملکرد فلوروفور را برای کاربردهای تحقیقاتی بیشتر از همیشه فراهم میکند.
انواع فلوروفورها؟
رنگهای آلی مصنوعی، مانند فلورسین (fluorescein)، بعنوان اولین ترکیبات فلورسنت مورد استفاده در تحقیقات بیولوژیکی محسوب میشوند. مشتقات این ترکیبات اصلی برای بهبود پایداری نور و حلالیت آنها تولید شده است. این رنگها به منظور بکارگیری در بیوکونژوگاسیون، به ویژه فلورسین ایزوتیوسیانات (FITC)، رودامین (تترا متیل رودامین ایزوتیوسیانات، TRITC) و انواع تجاری با عملکرد بیشتر تهیه شده اند. اندازه کوچک این فلورها به عنوان یک مزیت نسبت به فلوروفورهای زیستی برای استراتژیهای بیوکونژوگاسیون به شمار میآید، زیرا این فلورها میتوانند بدون تداخل در عملکرد بیولوژیکی، به ماکرومولکول‌هایی مانند آنتی‌بادی‌ها، بیوتین یا آویدین متصل شوند. طیف گسترده‌ای از رنگها با طیفهای تحریک/انتشار مشخص و بازده کوانتومی و ضرایب تحریک بهینه، بصورت تجاری برای هر کاربرد فلورسنت در دسترس هستند.
در حالیکه بیولومینسانس از حدود هزاران سال پیش شناخته شده است، اولین فلوروفور بیولوژیکی برای کاربردهای تحقیقاتی در دهه 1990 مورد استفاده قرار گرفت. در این مطالعه پروتئین فلورسنت سبز (GFP) از چتر دریایی Aequorea victoria شبیه سازی شد و به عنوان گزارشگر بیان ژن مورد استفاده قرار گرفت. از آن زمان، مشتقات GFP اصلی، فیکوبیلیپروتئین‌ها (آلوفیکوسیانین، فیکوسیانین، فیکواریترین، و فیکواریتروسیانین) و بسیاری از پروتئینهای دیگر برای استفاده در سیستمهای بیان بیولوژیکی طراحی شده اند و استفاده از آنها در حال حاضر در تحقیقات بیولوژیکی بسیار متداول است.
از جمله مزایای فلورفورهای زیستی این است که پلاسمیدهای بیانی را میتوان به باکتریها، سلولها، اندام‌ها یا موجودات کامل وارد کرد. این کار به محققان اجازه میدهد تا فرآیندهای بیولوژیکی را با ردیابی بیان فلوروفور به تنهایی یا ترکیب شده با پروتئین مورد نظر مطالعه کنند. با اینحال، استفاده از پروتئینهای فلورسنت میتواند زمان بر باشد. علاوه بر این، تولید مقادیر زیادی از این پروتئینها میتواند منجر به تولید گونه‌های اکسیژن فعال شود که ممکن است باعث واکنشهای ناخواسته یا سمیت در سیستم مورد مطالعه شود. علاوه بر این، اندازه پروتئین فلورسنت میتواند عملکرد بیولوژیکی طبیعی پروتئین سلولی را که فلوروفور به آن متصل میشود، تغییر دهد. در مقابل، فلوروفورهای بیولوژیکی ممکن است مانند رنگهای فلورسنت مصنوعی، مقاومت و حساسیت به نور را نداشته باشند.
نقاط کوانتومی (Quantum dots) نانوکریستال‌هایی با خواص شیمیایی منحصر بفرد هستند که امکان کنترل دقیقی بر ویژگیهای طیفی فلوئور را فراهم میکنند. نقاط کوانتومی اولین بار در دهه 1980 توسعه یافتند و از دهه 1990 بطور گسترده ای در کاربردهای فلورسنت در تحقیقات زیست شناسی مورد استفاده قرار گرفتند. نقاط کوانتومی کریستالهای نیمه هادی در ابعاد نانو (2 تا 50 نانومتر) هستند که هنگام تحریک، نور فلورسنت ساطع میکنند و طول موج نور بستگی به اندازه نقطه کوانتومی دارد.
نقاط کوانتومی کوچکتر انرژی بیشتری نسبت به نقاط کوانتومی بزرگ ساطع میکنند و بنابراین با افزایش اندازه نانوکریستال، نور ساطع شده از طول موج آبی به قرمز تغییر میکند. با در نظر گرفتن این نکته که اندازه نقاط کوانتومی را میتوان به شدت کنترل کرد، امکان تحریک و گسیل نور اختصاصی را فراهم میکند و آنها را برای کاربردهای فلورسنت در تحقیقات مفید میکند.
همچنین براساس مطالعات انجام شده در این زمینه مشخص شده است که نقاط کوانتومی نسبت به سایر فلوروفورها پایداری نوری بیشتری دارند. به عبارت ساده، نقاط کوانتومی بسیار پایدار هستند و میتوانند برای مدت طولانی، حتی تا 4 ماه در مطالعات تصویربرداری درون تنی یا in vivo، نور ساطع کنند که همین ویژگی، آنها را برای کاربردهای مختلف بیولوژیکی مانند برچسب زدن پروتئینها مفید میکند. با اینحال، نگرانیهایی در مورد سمیت بالقوه آنها برای سلولها در هنگام شکستن ذرات وجود دارد و همچنین ممکن است استفاده از آنها مقرون بصرفه نباشد.
شکل 4. طیف فلورسنت
انواع فلورسنت
فلورسنت یک پدیده فیزیکی موقت است که در آن اتمهای یک ماده با تابش الکترومغناطیسی با انرژی بالا انرژی میگیرند و برانگیخته میشوند. این پدیده را میتوان در هر دو نمونه غیرزنده و زنده مشاهده کرد. به عنوان مثال، مواد معدنی و سنگهای قیمتی مانند الماس، یاقوت، زمرد، کلسیت و کهربا هنگام قرار گرفتن در معرض اشعه ماورا بنفش یا اشعه ایکس رنگهای قابل مشاهده ای از خود ساطع میکنند.
یک مثال قابل توجه از فلورسانس در طبیعت، بیولومینسانس (bioluminescence) است که در آن فیتوپلانکتونهای بیولومینسانس کوچک هنگامیکه در آبهای دریایی غوطه ور میشوند، میدرخشند و از خود نور ساطع میکنند. این پدیده زمانی رخ میدهد که انرژی جنبشی آب دریا، اتم های موجود در ارگانیسم را برانگیخته میکند.
کلروفیل یکی دیگر از مواد فلورسنت طبیعی است که در گیاهان سبز یافت میشود. مسئول به دام انداختن نور خورشید و تبدیل آن به انرژی از طریق یک واکنش بیوشیمیایی است. این واکنش فقط در محدوده خاصی از طول موجها رخ میدهد و زمانیکه نور خورشید دیگر وجود ندارد، متوقف میشود. این رنگدانه تنها در حضور طیف خاصی از طول موج چنین رفتاری را نشان میدهد.
مقایسه هفت الماس در زیر نور خورشید در مقابل نور فرابنفش
کاربردهای فلورسنت
استفاده از فلورسنت مانند یک درخت بسیار گسترده است و در صنایع مختلف از جمله تحقیقات علمی تا صنایع داروسازی و پزشکی کاربرد دارد.
آنها نقش مهمی در اغلب حوزه‌های علمی و صنعتی دارند. این ترکیبات به دلیل ویژگیهای خاصی که دارند، از جمله حساسیت بالا، دقت بالا و طول موج نوری بلندتر از نور مرئی، در بسیاری از زمینه‌ها مورد استفاده قرار میگیرند. مهمترین کاربردهای فلورسنت شامل موارد زیر میشود:
- تحقیقات علمی : در زمینه‌های مطالعات شیمی، بیولوژی، فیزیک و دیگر علوم، فلورسنت‌ها به عنوان پروبها و برچسبهای نوری برای مطالعه و تشخیص مواد و فرآیندها مورد استفاده قرار میگیرند.
- پزشکی : در زمینه‌هایی مانند تصویربرداری پزشکی (مانند تصویربرداری با MRI و PET)، آنالیز بیولوژیکی (مانند تشخیص بیماریها و بررسی فرایندهای زیستی و تصویربرداری سلولی) و داروسازی (به عنوان وسیله‌ای برای ارسال داروها به محل مورد نیاز در بدن) فلورسنت به کار میرود.
- صنایع : در صنایع مختلف از جمله صنایع الکترونیک، مواد غذایی، رنگ و مواد شیمیایی، نساجی و غیره، فلورسنت به عنوان روشی برای تحقیقات و کنترل کیفیت محصولات مورد استفاده قرار میگیرد.
- نورپردازی : فلورسنت در نورپردازی نیز کاربرد دارد. برای مثال، در فتونیکها و چراغهای فلورسنت که در منازل، دفاتر و ساختمانها استفاده میشوند، این پدیده به کار میرود.
- کاتالیزورها : برخی از کاتالیزورها و الکترولیتها از خاصیت فلورسنت بهره میبرند. این مواد میتوانند واکنشها را تسریع کرده و به بهبود عملکرد فرایندهای شیمیایی کمک کنند.
- فناوری نانو : در دنیای فناوری نانو، فلورسنت به عنوان یک ابزار بسیار مهم برای مطالعه و تشخیص نانومواد و نانوذرات مورد استفاده قرار میگیرد.
بدین ترتیب، فلورسنت بخاطر ویژگیهای منحصر بفرد و کاربردهای متعددی که دارد، یکی از پدیده‌های مهم و مفید در علوم و صنایع مختلف بشمار میآید.
تفاوت بین فلورسنت و فسفرسانس
یک پدیده طبیعی دیگر که ویژگیهای مشابهی را با فلورسنت نشان میدهد، فسفرسانس نام دارد. در پدیده فسفرسانس یک ماده انرژی را جذب میکند و اتمهای تشکیل دهنده آن، انرژی را به شکل نور قابل رؤیت منتشر میکنند. در این بخش فهرستی از تفاوتها بین فسفرسانس و فلورسانس آمده است.
- در فسفرسانس، همانند فلورسنت انتشار نور قابل رؤیت به صورت فوری نیست. در واقع، انتشار نور برای مدت زمان بیشتری ادامه دارد. در فلورسنت، هنگامیکه منبع امواج الکترومغناطیس با انرژی بالاتر قطع شود، انتشار نور متوقف میشود. این بدان معناست که هنگامیکه منبع قطع شود، فلورسانس فوراً متوقف میشود در حالیکه فسفرسانس ادامه دارد.
- عمر اتمهای تحریک شده در فلورسانس بسیار کوتاه است. آنها به سرعت به وضعیت عادی خود باز میگردند. در فسفرسانس، اتمهای تحریک شده در طی زمان طولانیتری به سطح انرژی پایین میرسند.
- سطح انرژی ذرات فوتون منتشرشده کمتر از انرژی است که در فلورسنت جذب شده است. همین اتفاق در فسفرسانس هم رخ میدهد اما طول موج فوتونهای منتشرشده در فسفرسانس بیشتر از فلورسانس است.
- از جمله مثال‌های فلورسانس می توان به کلروفیل، مرجان‌ها، ویتامین‌ها و غیره اشاره کرد. مثال‌های فسفرسانس شامل فسفر، کرم‌های شبتاب، صفحات ساعت و غیره هستند.
