تکنیک FISH چیست؟ معرفی کامل به زبان ساده
هیبریداسیون فلورسانس درجا (Fluorescence In Situ Hybridization) یا به اختصار FISH یک تکنیک آزمایشگاهی سیتوژنتیک مولکولی به شمار می‌آید که برای شناسایی و تعیین موقعیت دقیق یک توالی خاص DNA روی کروموزوم‌ها به کار می‌رود. در تکنیک FISH، مجموعه کامل کروموزوم‌های یک فرد بر روی یک لام شیشه‌ای تثبیت می‌شود. سپس پروب‌های DNA (یک قطعه کوچک از DNA خالص که با رنگ فلوروسنت نشانه گذاری شده است)، به این لام اضافه می‌شوند.
پروب برچسب‌گذاری شده با فلورسنت توالی مکمل خود را در مجموعه کروموزوم‌ها پیدا کرده و به آن متصل می‌شود. با استفاده از یک میکروسکوپ ویژه، می‌توان کروموزوم و مکان زیرکروموزومی که پروب فلوروسنت به آن متصل شده است را مشاهده کرد. درک نحوه عملکرد FISH شامل شناخت نقش آن در دو دسته اصلی تکنیک‌های ژنتیکی است: سیتوژنتیک که کروموزوم‌ها و ناهنجاری‌های آن‌ها را مطالعه می‌کند و تجزیه و تحلیل مولکولی که بر روی DNA و توالی ژن تمرکز دارد.
معرفی تکنیک FISH
هیبریداسیون فلوروسانس درجا، به عنوان یک تکنیک پیشرفته در زیست شناسی مولکولی محسوب می‌شود که به پژوهشگران این امکان را می‌دهد تا مناطق خاصی از DNA را درون سلول‌ها مشاهده کرده و مورد مطالعه قرار دهند. پروب‌ها یا کاوشگرهای برچسب گذاری شده با فلورسانس که در تکنیک FISH به کار می‌روند به محققان اجازه می‌دهد تا مکان دقیق این توالی‌های ژنتیکی را با دقت بالایی شناسایی کنند.
در اصل، FISH شامل هیبریداسیون رشته‌های مکمل DNA یا RNA به توالی‌های هدف خود درون سلول است. در این تکنیک پروب‌ها به گونه‌ای طراحی شده‌اند که به طور خاص، به توالی ژنتیکی مورد نظر متصل شوند و با برچسب‌های فلورسنت نشان‌گذاری شده‌اند. هنگامی که این پروب‌های برچسب‌گذاری شده با فلورسنت در معرض نور ماوراء بنفش یا تحریک لیزری قرار می‌گیرند، سیگنال‌های نوری قابل مشاهده‌ای تولید می‌کنند که می‌توان آن‌ها را زیر میکروسکوپ شناسایی و تحلیل کرد.
فرایند دناتوراسیون و هیبریداسیون در FISH
تکنیک قدرتمند FISH برای تجزیه و تحلیل DNA از فرآیندهای دناتوراسیون و تغییر ساختار استفاده می‌کند. در شرایط عادی، DNA به دلیل پیوندهای هیدروژنی بین جفت نوکلئوتیدها (دو پیوند بین آدنین و تیمین؛ سه پیوند بین سیتوزین و گوانین) یک مارپیچ دوگانه پایدار تشکیل می‌دهد.
زمانی که DNA در معرض عوامل فیزیکی مانند گرما یا مواد شیمیایی قرار گیرد، می‌تواند دناتوره شود. دناتوراسیون به این معنی است که دو رشته از هم جدا می‌شوند. اگر شرایط مناسب باشد، DNA می‌تواند به شکل اولیه خود بازگردد.
در FISH، پروب‌های DNA نشاندار شده با فلورسنت که مکمل توالی‌های خاص روی DNA دناتوره شده هستند، با توالی DNA هیبرید می‌شوند. این هیبریداسیون، فلورسانس ساطع کرده و امکان مشاهده DNA را در زیر میکروسکوپ فلورسنت فراهم می‌کند.
FISH به عنوان یک تکنیک پیشرفته در سیتوژنتیک، در شناسایی ناهنجاری‌های کروموزومی مرتبط با اختلالات ژنتیکی مانند سندرم داون و سرطان‌ها و همچنین در مطالعه الگوهای بیان ژن نقش مهمی ایفا می‌کند.
این تکنیک به درک سازماندهی ژنوم و بیان ژن در سطح سلولی کمک می‌کند و ابزار ضروری برای پژوهش‌های بیولوژیکی پیچیده و پزشکی شخصی به شمار می‌آید.
فرآیند انجام تکنیک FISH
در روش هیبریداسیون فلورسانس درجا، به طور مستقیم در یک سلول، با استفاده از تیمارهای شیمیایی و با توالی‌های مکمل، پروب‌های DNA یا RNA بر روی کروموزوم‌ها هیبرید می‌شوند. پروب‌های برچسب گذاری شده با فلورسنت هنگامی که توالی مکمل خود را (که توالی مورد نظر ما است) پیدا می‌کنند، هیبرید می‌شوند و نور فلورسانس ساطع می‌کنند.
سیگنال‌ها با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس ثبت و بررسی می‌شوند. پروب‌های غیرمتصل، شسته شده تا از سیگنال‌های ناخواسته در محل هیبریداسیون جلوگیری شود.
تکنیک FISH مرحله به مرحله
- انتخاب توالی هدف: مرحله اول انتخاب یک توالی به عنوان توالی هدف است که می‌تواند مربوط به ناهنجاری‌های کروموزومی یا ژن‌های خاص باشد. نکته مهم این است که این توالی باید دارای چندین هزار جفت باز باشد و از طریق تحلیل محاسباتی انتخاب شود.
- طراحی و ساخت پروب: پروب‌های نشاندار شده با فلورسنت برای اتصال به توالی‌های DNA خاص مورد نظر طراحی می‌شوند. این کاوشگرها دارای فلوروفورهایی هستند که هنگام قرار گرفتن در معرض طول موج‌های خاصی نور ساطع می‌کنند.
- آماده سازی نمونه: نمونه با مواد شیمیایی تیمار می‌شود تا سلول‌ها را تثبیت کرده و غشاها را نفوذپذیر کند، طوری که به پروب‌ها اجازه ورود بدهد. برای اتصال بهتر پروب، DNA دو رشته‌ای نمونه باید دناتوره شود. این کار معمولا با استفاده از گرما یا عوامل قلیایی انجام می‌شود.
- هیبریداسیون: نمونه آماده شده با پروب‌های نشاندار شده در تماس قرار داده می‌شود تا پروب‌ها به توالی‌های DNA مکمل خود متصل شوند.
- شستشو: پس از هیبریداسیون، پروب‌های غیرمتصل و اضافی شسته می‌شوند تا سیگنال‌های پس زمینه به حداقل برسد.
- مشاهده: درپایان، نمونه با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مشاهده می‌شود. هنگامی که نور مناسب اعمال می‌شود، پروب‌های هیبرید شده سیگنال‌های فلورسنت منتشر می‌کنند که قابل مشاهده و تجزیه و تحلیل هستند.
این مراحل که به طور مختصر بیان شد، به شناخت مراحل مهم اجرای موثر FISH کمک می‌کند. FISH اطلاعاتی در مورد سازماندهی ژنوم، بیان ژن، ناهنجاری‌های کروموزومی و موارد دیگر ارائه می‌دهد. با استفاده از پروب‌های رنگی متعدد در یک آزمایش، محققان می‌توانند اطلاعات بیشتری در مورد فرآیندهای سلولی به دست آورند.
انواع تکنیک‌های FISH
هیبریداسیون فلورسانس درجا فرایندی است که طی آن توالی‌های DNA خاص در سلول‌ها یا بافت‌ها مورد بررسی قرار می‌گیرند. این تکنیک در بسیاری از زمینههای زیست شناسی، ژنتیک و پزشکی کاربرد دارد. انواع مختلفی از تکنیک FISH وجود دارد که در ادامه به معرفی برخی از آن‌ها می‌پردازیم:
۱. تکنیک DNA FISH
۲. تکنیک RNA FISH
۳. کاریوتایپینگ طیفی (SKY)
این روش رایج‌ترین نوع از تکنیک‌های FISH به شمار می‌آید که از پروب‌های فلورسنت برای تشخیص توالی‌های DNA خاص در هسته استفاده می‌کند. این روش برای مطالعه ناهنجاری‌های کروموزومی، تکثیر ژن و بازآرایی به کار می‌رود.
این نوع از تکنیک FISH به طور خاص مولکول‌های RNA را هدف قرار می‌دهد و برای محققان این امکان را فراهم می‌کند تا بیان ژن و ترجمه رونوشت‌های mRNA را مطالعه کنند.
این تکنیک تخصصی، رنگ آمیزی سنتی کروموزوم را با پروب‌های FISH ترکیب کرده تا تصویر طیفی جامعی از همه کروموزوم‌ها ایجاد کند. کاریوتایپینگ طیفی به ویژه برای شناسایی تغییرات پیچیده کروموزومی در تحقیقات سرطان مورد استفاده قرار می‌گیرد.
۴. تکنیک Multiplex FISH
این تکنیک به طور خاص برای شناسایی و ارزیابی چندین توالی DNA با استفاده از مجموعه‌ای از پروب‌های فلوروسنت به کار می‌رود. این پروب‌ها می‌توانند به نواحی خاصی از ژنوم متصل شوند و به محققان این امکان را می‌دهند که توالی‌های مختلف را در یک نمونه واحد شناسایی کنند و اطلاعاتی را در مورد جهش‌ها و ناهنجاری‌های ژنتیکی ارائه می‌دهد.
این تکنیک، روش PCR رونویسی معکوس را با FISH ترکیب می‌کند تا سطوح بیان RNA را در سلول‌ها تشخیص دهد.
۵. تکنیک RT-FISH
۶. تکنیک Q-FISH
این روش، شدت فلورسنت مواد ژنتیکی هیبرید شده را برای اهداف کمی اندازه گیری می‌کند. Q-FISH در مطالعات مربوط به تلومرها، پیری، سرطان و بیان ژن استفاده می‌شود.
این نوع از تکنیک FISH، ترکیبی از FISH با فلوسیتومتری است و سیگنال‌های فلورسنت از سلول‌های منفرد را مشخص می‌کند و تجزیه و تحلیل دقیق جمعیت‌های سلولی را ممکن می‌سازد.
۷. تکنیک Flow-FISH
۸. تکنیک e-FISH
این نوع، یک ابزار محاسباتی است که از داده‌های توالی، برای پیش بینی نتایج آزمایش‌های FISH استفاده می‌کند و این یک برنامه مبتنی بر BLAST است و به تخمین سیلیکو هیبریداسیون (به فرایندهای مبتنی بر تحلیل داده‌های بیولوژیکی اشاره دارد که از تکنیک‌های محاسباتی برای شبیه سازی تعاملات بین مولکول‌های زیستی، مانند DNA و RNA، استفاده می‌کند) کمک می‌کند.
۹. تکنیک Fiber-FISH
این روش شامل استفاده از فیبرهای کروماتین یا DNA برای نقشه برداری ژن با وضوح بالا است که امکان تشخیص ساختارهای DNA کوچکتر از 1000 جفت باز را فراهم می‌کند. این تکنیک برای تجزیه و تحلیل شکاف‌ها، همپوشانی‌ها، تکرارها و سایر تغییرات غیرقابل تشخیص توسط FISH معمولی مفید است.
۱۰. تکنیک ACM-FISH
یک نوع FISH چند رنگ است که به طور اختصاصی برای سلول‌های اسپرم طراحی شده است. از این روش برای تشخیص نقش آسیب کروموزومی (توالی‌های تکراری یا حذف) در ناباروری مردانه استفاده می‌شود.
هر کدام از انواع تکنیک‌های FISH با توجه به نیازهای تحقیقاتی، کاربردها و مزایای منحصر به فردی دارد. این تکنیک‌های مختلف FISH قابلیت‌های آنالیز ژنتیکی را گسترش می‌دهند و برای محققان این امکان را فراهم می‌کند تا کروموزوم‌ها را مطالعه کرده، مواد ژنتیکی را کمی سازی کنند و الگوهای بیان ژن را با جزئیات مورد بررسی قرار دهند.
کاربردهای تکنیک FISH
در حال حاضر، تکنیک هیبریداسیون فلورسانس در محل، به یک تکنیک کلیدی در زیست شناسی مولکولی و سیتوژنتیک تبدیل شده است و کاربردهای گسترده‌ای در حوزه‌های مختلف دارد. این روش به ویژه در شناسایی ناهنجاری‌های خاص کروموزومی، مانند حذف، تکرار و جابجایی، بسیار مفید است و به ابزاری ضروری در تشخیص و پیش‌آگهی سرطان بدل شده است. با به کارگیری پروب‌های هدفمند، FISH می‌تواند ناهنجاری‌های ژنتیکی مرتبط با انواع مختلف سرطان‌ها را شناسایی کرده و در شناسایی تومور و پیگیری پیشرفت بیماری مؤثر باشد.
کاربرد انواع پیشرفته FISH
انواع پیشرفتهای از FISH مانند کاریوتایپینگ طیفی (SKY) و FISH چندرنگی (M-FISH) هستند که قابلیت‌های این تکنیک را با استفاده از پروب‌های رنگی مختلف برای هر کروموزوم بهبود می‌بخشند. این تکنیک‌ها به محققان این امکان را می‌دهند تا بازآرایی‌های کروموزومی و ناهنجاری‌های ژنتیکی پیچیده را مشاهده کنند. با این حال، این روش‌ها ممکن است در شناسایی حذف‌ها یا تکرارهای کوچکتر محدودیت‌هایی داشته باشند.
FISH در آزمایش‌های پیش از تولد
FISH همچنین در آزمایش‌های پیش از تولد برای شناسایی ناهنجاری‌های کروموزومی مانند سندرم داون از طریق تحلیل سلول‌های جنینی به طور گسترده‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرد. در نقشه برداری ژنتیکی، این تکنیک به شناسایی کروموزوم‌های نشانگر و تعیین نقاط شکست مرتبط با جابجایی‌های کروموزومی کمک می‌کند.
سایر کاربردهای FISH
جنبه کمی FISH در نظارت بر پیشرفت بیماری و ارزیابی پاسخ‌های درمانی بسیار حائز اهمیت است. زمانی که کاریوتایپینگ‌های مرسوم قادر به شناسایی ناهنجاری‌ها نیستند، FISH اینترفاز می‌تواند نتایج دقیق‌تری ایجاد کند و اطلاعات تازه ای درباره ساختارها و سازمان‌های کروموزومی ارائه کند.
علاوه بر این، FISH در تجزیه و تحلیل تنوع و توزیع میکروارگانیسم‌ها در نمونه‌های محیطی و در پزشکی قانونی که در آن برای تطبیق DNA موجود در صحنه جرم استفاده می‌شود، نقشی کلیدی ایفا می‌کند.
این تکنیک همچنین در نظارت بر موفقیت پیوندهایی مانند پیوند مغز استخوان کاربرد دارد که نشان دهنده تطبیق پذیری و کاربردهای گسترده آن در تحقیقات پزشکی، تشخیصی، ژنتیک، میکروبیولوژی و زمینههای دیگر است. با پیشرفت فناوری، پیش بینی می‌شود که کاربردهای FISH بیش از این گسترش یابد و درک ما از ژنتیک و تأثیر آن بر سلامت و بیماری را افزایش دهد.
مزایای تکنیک FISH
در این بخش در مورد مزایای به کارگیری تکنیک FISH صحبت می‌کنیم:
۱. مشاهده توالی‌های ژنتیکی:
FISH به محققان اجازه می‌دهد تا توالی‌های DNA یا RNA خاصی را در سلول‌ها مشاهده کنند و اطلاعات دقیقی در مورد مکان و بیان ژن ارائه دهند.
۲. بررسی سازماندهی کروموزوم:
این تکنیک به مطالعه سازماندهی کروموزوم‌ها و شناسایی تغییرات ژنتیکی کمک می‌کند و در درک مکانیسم‌های بیماری موثر است.
۳. حساسیت بالا:
FISH روشی است که از حساسیت بالایی برخوردار است و می‌تواند مقادیر کمی از DNA یا RNA هدف را شناسایی کند.
۴. تحقیقات سرطان:
این روش، در شناسایی ناهنجاری‌های کروموزومی در تومورهای مختلف موثر است و یکی از تکنیک‌های مهم مورد استفاده در تحقیقات سرطان محسوب می‌شود.
۵. تشخیص قبل از تولد:
FISH می‌تواند ناهنجاری‌های کروموزومی جنین را با استفاده از نمونه خون مادر تشخیص دهد و یک ابزار تشخیصی غیرتهاجمی برای تشخیص‌های پیش از تولد ارائه می‌دهد.
۶. تطبیق پذیری:
این تکنیک را می‌توان هم برای سلول‌های تقسیم نشده و در حال تقسیم به کار برد و همین ویژگی آن را برای تجزیه و تحلیل در مراحل مختلف چرخه سلولی مناسب می‌کند. FISH همچنین امکان مطالعه کروموزوم‌ها در سلول‌های تومور جامد را فراهم می‌کند که با کاریوتایپینگ معمولی که نیاز به سلول‌ها در متافاز دارد، امکان پذیر نیست.
۷. بدون نیاز به کشت سلولی:
بر خلاف کاریوتایپینگ معمولی، FISH به کشت سلولی زمانبر و حساس به آلودگی نیاز ندارد و این امر آن را نسبت به سایر روش‌ها سریعتر و کارآمدتر می‌کند.
۸. پروب‌های چندگانه و مکان‌های هیبریداسیون:
FISH از پروب‌های متعدد و فلوروفورهای مختلف برای تجزیه و تحلیل مکان‌های هیبریداسیون مختلف استفاده می‌کند و از محدودیت‌های کاریوتایپینگ که صرفاً بر روی نواربندی کروموزوم متکی است، فراتر می‌رود.
۹. واکنش متقاطع کم:
پروب‌های FISH واکنش متقاطع پایینی از خود نشان می‌دهند که همین امر، اختصاصیت نتایج را افزایش می‌دهد.
۱۰. نسبت سیگنال به نویز بالاتر:
این تکنیک به دلیل نسبت سیگنال به نویز بالاتر، نتایج واضح‌تر و قابل تفسیرتری را ارائه می‌دهد.
۱۱. مناسب برای انواع نمونه:
FISH را می‌توان بر روی انواع مختلف نمونه، از جمله بافت‌های تعبیه شده در پارافین، بافت‌های منجمد و سلول‌های کشت داده شده انجام داد. این نمونه‌ها هم سلول‌های تقسیم نشده و هم در حال تقسیم را در خود جای می‌دهند.
محدودیت‌های FISH
با وجود این که تکنیک FISH مزایای قابل توجهی دارد، اما محدودیت‌هایی نیز در به کارگیری این تکنیک وجود دارد که باید در نظر گرفته شوند.
یکی از این محدودیت‌ها این است که این تکنیک به دانش قبلی درباره توالی هدف مورد مطالعه نیاز دارد تا پروب‌های آن به طور متناسب طراحی شوند. به دست آوردن این پروب‌ها اغلب زمانبر و پرهزینه است.
از دیگر محدودیت‌های این روش می‌توان به این مورد اشاره کرد که تنها تعداد محدودی از توالی‌های هدف می‌توانند به طور همزمان با استفاده از روش‌های میکروسکوپی فلورسانس سنتی شناسایی شوند، زیرا فلوروفورهای استفاده شده برای برچسب گذاری پروب اغلب همپوشانی‌های طیفی دارند. با این حال، تکنیک‌های جدیدی مانند FISH چندگانه توسعه یافته‌اند تا با استفاده همزمان از فلوروفورهای رنگی مختلف، این محدودیت را برطرف کنند.
تفسیر نتایج به دست آمده از طریق FISH ممکن است به تخصص در سیتوژنتیک یا زیست شناسی مولکولی نیاز داشته باشد، زیرا در صورت عدم اجرای کنترل‌های مناسب در طول طراحی آزمایش یا تحلیل داده‌ها، ممکن است نتایج مثبت کاذب یا منفی کاذب ایجاد شود.
پیشرفتهای روزافزون در زمینه تکنیک‌های مختلف FISH در حال رفع این محدودیت‌ها هستند و طراحی پروب‌های کارآمدتر را توسعه می‌دهند.
آینده فناوری FISH
تکنیک‌های هیبریداسیون فلورسانس در جا، در طول سال‌ها پیشرفتهای چشمگیری داشته است و فرصت‌های جدیدی را برای کاربردهای تشخیصی و تحقیقاتی به وجود آورده است. همان طور که تکنولوژی به تکامل خود ادامه می‌دهد، آینده فناوری FISH نیز امیدوار کننده به نظر می‌رسد. یکی از زمینههای توسعه FISH، بهبود تکنیک‌های طراحی و سنتز پروب است. محققان در حال بررسی راه‌هایی برای افزایش اختصاصیت و حساسیت پروب هستند که امکان تشخیص دقیق‌تر توالی‌های DNA هدف را فراهم می‌کند. همین امر می‌تواند به بهبود دقت تشخیصی و افزایش وضوح در تجزیه و تحلیل ژنتیکی منجر شود. در ادامه به نکات کلیدی در مورد آینده ی تکنیک FISH اشاره می‌شود:
۱. طراحی کاوشگر بهبود یافته:
۲. ادغام با سایر ابزارها
۳. پیشرفت در تصویربرداری
محققان در حال مطالعه بر روی افزایش اختصاصیت و حساسیت پروب‌های FISH هستند که منجر به تشخیص دقیق‌تر توالی‌های DNA هدف می‌شود. پیش بینی می‌شود، پیشرفت در طراحی کاوشگرها، دقت تشخیصی و وضوح تجزیه و تحلیل ژنتیکی را اصلاح کند.
FISH با سایر تکنیک‌های زیست شناسی مولکولی مانند توالی یابی نسل جدید و طیف سنجی جرمی ترکیب می‌شود. این رویکرد بین رشته‌ای، درک بهتر و عمیق فرآیندهای سلولی و شناسایی تغییرات ژنتیکی مرتبط با بیماری‌ها را تسهیل می‌کند.
روش‌های میکروسکوپی با وضوح بالا، برای مشاهده ساختارهای زیرسلولی با وضوح بیشتری در حال توسعه هستند. توانایی ترکیب کردن این فناوری‌ها، مطالعات دقیق بازآرایی‌های ژنومی و سازماندهی سلولی را امکان پذیر می‌کند.
۴. کاربردهای جدید
فراتر از سیتوژنتیک سنتی، محققان در حال بررسی استفاده از FISH برای مطالعه دینامیک RNA و سازماندهی کروماتین در هسته هستند. این برنامه‌های کاربردی جدید کاربرد FISH را گسترش می‌دهند و اطلاعاتی را در مورد تنظیم ژن و ساختار ژنوم ارائه می‌کنند.
به طور کلی، انتظار می‌رود آینده فناوری FISH از طریق پیشرفتهای مداوم در طراحی کاوشگر، ادغام با سایر تکنیک‌ها، فناوری‌های تصویربرداری و کاربردهای نوآورانه، دقت، تطبیق پذیری و عمق بیشتری را برای مطالعه مواد ژنتیکی به وجود آورد.
پارس ژن پویا
بهبود کیفیت و افزایش دقت آنالیزهای سیتوژنتیک در آزمایشگاه‌های سیتوژنتیک از اهمیت بالایی برخورداز است . شرکت پارس ژن پویا با ارائه تجهیزات و نرم افزارهای تخصصی سیتوژنتیک از برندهای معتبر جهان انتخابی مناسب برای ارتقا سطح کیفی ازمایشگاه شما است. برای مشاهده انواع تجهیزات و نرم افزارهای سیتوژنتیک به بخش محصولات سایت مراجعه فرمایید.
منابع: pmc.ncbi.nlm،geneticeducation، genome، nature