NGS

NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS)

با ظهور روش توالی یابیSanger، علوم مرتبط با زیست شناسی دچار تحولات بزرگ و بنیادینی شدند؛ اما با پیشرفت سریع دانش بشری و نیاز به تکنولوژی های پیشرفته استفاده از این روش دیگر جوابگوی نیازهای محققین رشته های متفاوت زیست شناسی و پزشکی نبود، تا اینکه در سال ۲۰۰۴ میلادی اولین روش توالی یابی همزمان با حجم بالا بصورت تجاری رونمایی شد. به علت شکل-گیری این تکنولوژی جدید پس از روش توالی یابیSanger، این تکنولوژی با عنوان Next Generarion Sequencing (NGS) معرفی می گردد.

امروزه ۵ روش متفاوت NGS جهت دست یابی به اطلاعات ژنتیکی وجود دارد که پر کاربردترین آن ها تکنولوژی ارائه شده به وسیله شرکت Illumina و استفاده از روش کاملا انحصاری آن شرکت یعنی توالی یابی حین سنتز (Sequencing by Synthesis یا SBS) است.

در این تکنولوژی پس از ایجاد کتابخانه ی DNA از منبع مورد مطالعه، توالی یابی صورت می گیرد که اعضای تشکیل دهنده ی هر کتابخانه بوسیله ی اتصال مولکول های linker به دو انتهای مولکول های خطی DNA ایجاد می شوند. منبع DNAی تشکیل دهنده ی کتابخانه می تواند DNAی ژنومی، مولکول هایRNA و یا توالی های خاصی از DNA باشد که بوسیله ی PCR تکثیر شده اند.

در این روش، تکثیر به منظور توالی یابی بر روی flow cell و به روش Bridge-PCR است که پس از تهیه ی کتابخانه و قرار گرفتن آن بر روی flow cell و انجام Bridge-PCR، دستجاتی از مولکول هدف با تراکم حدود ۱ میلیون مولکول دورشته ای ایجاد می گردد که با دناتوره کردن آن ها، الگوی تک رشته ی لازم جهت توالی یابی بوسیله ی نوکلئوتیدهای فلورسنت فراهم می-گردد. در این روش هر نوکلوتید به وسیله یک فلوروفور در موقعیت ۳’OH بلوکه شده است که پس از قرارگیری نوکلئوتید اختصاصی در رشته ی در حال رشد، سیگنال ساطع شده ثبت و سپس دور جدیدی از سنتز آغاز می شود. با ادامه این روش در نهایت توالی نوکلئوتیدی مولکول های مورد نظر با دقت بسیار بالا در اختیار کاربر جهت اهداف بعدی قرار می گیرند. امروزه به کمک این تکنولوژی می توان با دقت بسیار بالا نسبت به سایر روش های موجود و با هزینه ای به مراتب کمتر اقدام به توالی یابی منابع متفاوت از اسید نوکلئیک کرد.

برخی از توانایی های NGS به روش SBS:

۱- Whole Genome Sequencing

۲- Whole Exome Sequencing

۳- Transcriptome Sequencing

۴- Methylome Sequencing

۵-Small RNA Sequencing

۶- ChIP Sequencing

۷- De Novo Sequencing

۸- Metagenomics Sequencing

در حال حاضر اولین و تنها مرکز ارائه کننده خدمات NGS در ایران، درمانگاه تخصصی ژنتیک دکتر فقیهی در شیراز است که با آخرین تکنولوژی روز دنیا یعنی تکنولوژی Illumina و زیر نظر متخصصان زبده علوم سلولی و مولکولی و ژنتیک پزشکی اقدام به ارائه خدمات در زمینه NGS در کمترین زمان ممکن (کمتر از ۸ هفته کاری) با بهترین کیفیت مطابق با بالاترین استانداردهای جهانی در زمینه های متفاوت تحقیقاتی زیست-پزشکی نموده است. همچنین وجود دستگاه هایی با تکنولوژی روز دنیا در ایران مزایایی فراوانی را به دنبال دارد که از مهمترین آن ها می توان به موارد زیر اشاره داشت:

۱- انجام کلیه مراحل آماده سازی توسط تیم کاملا دوره دیده و مجرب NGS

۲- مسئولیت پذیری بالای مرکز ارائه دهنده خدمات NGS چه در مراحل انجام آزمایش و چه در هنگام آنالیز بیوانفورماتیک

۳- تایید سریع نتایج حاصل از NGS به وسیله توالی یابی Sanger در مرکز

۴- مقایسه تمامی نتایج حاصل از NGS با نتایج قبلی درمانگاه

۵- تایید نهایی نتایج حاصل از NGS توسط متخصص توالی یابی نسل جدید (دکتر فقیهی؛ فلوشیپ توالی یابی نسل جدید NGS از آمریکا و سوئد)

۶- انجام آزمایشات به صورت اورژانس (موارد بارداری، تشخیص پیش از تولد، انجام اعمال جراحی پیوند و …)

۷- امر مشاوره در انجام کلیه آزمایشات NGS زیر نظر افراد مجرب

همچنین این درمانگاه در چهار طبقه و مشتمل بر هشت بخش متفاوت (ژنتیک مولکولی، سیتوژنتیک، مشاوره ژنتیک، بخش تحقیقاتی، متخصص زنان و زایمان، متخصص اطفال، سونوگرافی، بخش مشاوره و مددکاری بیماری های ژنتیکی) در سال جاری افتتاح و شروع به کار نموده است. تعدادی از خدمات قابل ارائه توسط این درمانگاه عبارتند از: سیتوژنتیک مولکولی، کاریوتایپ با تفکیک بالا، الکتروفورز موئینه و توالی یابی به روش Sanger، MLPA، بررسی سندرم X شکننده، PGD و PND، مطالعه بیماری های عضلانی متفاوت و مشاوره در امر بیوانفورماتیک.

قابل ذکر است که بخش تحقیقاتی درمانگاه تخصصی ژنتیک دکتر فقیهی در حال حاضر اقدام به انجام پروژه هزار اگزوم ایرانی، انجام مطالعات پایه در زمینه بهینه سازی تکنولوژی NGS و مطالعات پایه ای متفاوت در زمینه بیماری های ژنتیکی و تاثیر متفاوت هر جهش بیماریزا نموده است. در رابطه با پروژه هزار اگزوم ایرانی (با پیشرفت بیش از پنجاه درصدی) می توان خاطر نشان کرد که با تکمیل این پروژه در آینده ای بسیار نزدیک بتوان علاوه بر دسترسی به بار ژنتیکی(genetic load) جمعیت ایران و شناسایی جهش های بیماریزای جمعیت، گام های بسیار بلندی در کاهش بسیار چشم گیر زمان تشخیص و هزینه های مرتبط با آن برداشت تا بتوان با کمک آن در زمینه درمان بیماری های ژنتیکی وراثتی و اکتسابی (سرطان و سایر بیماری های چندعاملی) به موفقیت های بزرگی رسید.

درمانگاه تخصصی ژنتیک دکتر فقیهی افتخار دارد در سایر زمینه های ژنتیک مولکولی و پزشکی با تمامی پزشکان، متخصصین ژنتیک مولکولی و پزشکی و سایر محققین علوم زیست شناسی و پزشکی همکاری نماید.

 

 

آزمایش NIPT یا NIFTY


تست غیرتهاجمی تشخیص پیش از تولد
اختلالات کروموزومیcell free DNA
درسال ۱۹۹۷ دانشمندان به وجودDNA جنین درخون زنان باردارپی بردند. این کشف مهم که با ردیابی قسمت‌هایی ازکروموزمYجنین درسرم مادرتوسط Dennis Lo صورت گرفت، اساسی شد برای ظهــور روش‌های غیرتهاجمی تشخیص آنوپلوئیدی‌ها در دوران بارداری. اصـول این روش برپایه اندازه¬گیریDNA  آزاد در پلاسمای مادر (cell free DNA) است که ازسلول‌های جفت آزاد می¬شوند. صاحب¬نظران، این کشف را انقلابی در علوم پرناتولوژی دانسته وپیش¬بینی می¬کنند که درآینده نزدیک تست¬های مبتنی برآن، جایگزین روش¬های رایج غربالگری گردد.

روش مولکولی غیرتهاجمی تشخیص آناپلوئیدی ها

به‌طورکلی تمرکز برنامه‌های غربالگری دوران بارداری برروی تشخیص سندرم داون، (۱)NTDs و دو آنوپلوئیدی اتوزومال دیگر که کمتر شایع هستند یعنی تریزومی ۱۸ (سندرم ادوارد) وتریزومی ۱۳(سندرمPatau) است. سندرم داون یا تریزومی ۲۱ شایع ترین آنوپلوئیدی درانسان با شیوع تقریباً ۱ در ۸۰۰ است. ریسک ابتلا جنین به سندرم داون با افزایش سن زیاد می شود، به طوری که یک خانم ۴۵ ساله دارای ریسک ۱ به ۳۵ است. امروزه پيشرفت ‌های علم پزشکی درمان اکثر مشکلات مبتلایان به این سندرم را امکان‌ پذير ساخته است، به گونه ای که افراد با سندرم داون تا سنين بالا (حدود ۵۵ سالگی) می‌توانند زندگی کنند.  تریزومی های ۱۸ و ۱۳ نیز مانند سندرم داون در سه ماهه اول و دوم شایع تر از موقع زایمان بوده و به میزان زیادی سقط خود به خودی در آنها اتفاق می افتد. مبتلایان به تریزومی ۱۸ و ۱۳ دارای عمرکوتاه مدتی بوده و فقط ۵ تا ۱۰ درصد آنها تا یک سالگی زنده می مانند.

سندرم های حذفی Deletion Syndromes

سندرم های حذفی به عنوان گروهی از اختلالات قابل تشخیص بالینی محسوب می شوند که به دلیل حذف بخشی از کروموزوم ایجاد می شوند. اندازه و محل حذف، ویژگی های تظاهرات بالینی و شدت آنها را تعیین می کنند. تظاهرات بالینی می تواند شامل تاخیرات رشدی، ناتوانی های ذهنی، تفاوتهای رشدی، مشکلات رفتاری، سختی های تغذیه ای، تون عضلانی پایین، تشنج، دیسمورفی باشد.

 

آنوپلوئیدی های کروموزوم جنسی

آنیوپلوییدهای کروموزوم جنسی شامل اختلالات عددی در کروموزوم X و  Y  به صورت حذفی یا اضافه شدن هستند.اگرچه علایم بالینی مبتلایان عموما خفیف بوده و بدون ناتوانایی های ذهنی است اما بعضی ها دچار مشکلات فنوتیپی مثل اختلالات فیزیکی، تاخیر در یادگیری و ناباروری هستند.
در این تست علاوه بر جنسیت جنین آنوپلوئیدی‌های کورموزم‌های جنسی مانند سندرم ترنر نیز از هفته دهم قابل تشخیص است.

 

درطی دو دهه اخیر روش‌های مختلفی شامل اندازه‌ گیری مارکرهای شیمیایی و پارامترهای سونوگرافی و همچنین ترکیب این دو باهم، برای غربالگری سندرم داون ابداع شده است، اما به علت اشکالات موجود دراین روش‌ها، دانشمندان همیشه به دنبال یافتن روش‌هایی بهتر بودند. بزرگترين ايراد در روش‌های سنتی غربالگری، درصد بالای نتايج مثبت و منفی کاذب و در تست‌های تأئيدی احتمال سقط جنين به علت تهاجمی بودن روش نمونه‌گيری است. درروش NIPT بدون نياز به سلول‌های بافت جفت (۳)(CVS) يا نمونه‌گيری از مايع آمنيوتيک (آمنيوسنتز)، ازچند ميلي ليتر خون وريدی مادر استفاده شده و درصد موارد مثبت و منفی کاذب نيز به ميزان کمتر از ۱ درصد کاهش می‌يابد.

بزرگترين ايراد روش‌های سنتی غربالگری، درصد بالای نتايج مثبت و منفی کاذب است.

درسال ۱۹۹۷ دانشمندان به وجود DNA جنین درخون مادر پی بردند. این کشف مهم که با ردیابی قسمت‌هایی ازکروموزمY جنینی درسرم مادرتوسط Dennis Lo صورت گرفت، اساسی شد برای ظهور روش‌های غیرتهاجمی تشخیص آنوپلوئیدی‌ها در دوران بارداری. اصول این روش بر پایه اندازه گیریDNA آزاد در پلاسما است که ازسلول‌های مرده جفت آزاد می‌شـوند. صاحب نظران این کشف را یک انقلاب در علوم تشخیصی می‌دانند و پیش بینی می‌کنند که در آینده نزدیک جایگزین تست‌های رایج غربالگری و تشخیص دوران بارداری گردد.  بالاخره موفقیت واقعی درسال ۲۰۰۸ حاصل شد، زمانی که دو گروه مستقل ازمحققین با مطالعه بر روی دو جمعیت ۱۸ و ۱۴ تایی ازجنین‌‌های مبتلا به آنوپلوئیدی، قدرت تشخیص تریزومی‌های جنین را با استفاده از تکنیک Massively Parallel Sequencing با درستی بیشتر از ۹۹ درصد به اثبات رساندند.

 


تکنیک آزمایش به این صورت است که ابتدا ۵۰ جفت (BP)(2) از فراگمنت¬های DNA جنین در خون مادر تعیین توالی شده سپس با استفاده از محاسبات و نقشه برداری‌های بیوانفورماتیک تعداد کروموزم‌های جنین محاسبه می‌شود.
NIFTY میلیون ها قطعات DNA   مادری و جنینی را در هر نمونه تعیین توالی می کند. با استفاده از تکنولوژی Next Generation Sequencing کل ژنوم و چهار آنالیز متفاوت بیوانفورماتیک اختصاصی، اطلاعات در طول کل ژنوم آنالیز شدخ و با مراجع استاندارد مقایسه می شود تا به اختلالات ژنتیکی مشخص شود.

نیمه عمر این DNA بسیار کوتاه بوده وکمتر از ۲ ساعت می باشد و بلافاصله بعد از تولد از خون مادر محو می‌گردد، بنابراین بارداری‌های قبلی اختلالی درنتیجه تست ندارد. برای جلوگیری از کاهش میزان DNA  خون مادر در لوله‌های حاوی ماده مخصوصی گرفته می‌شود که مقدار DNA را ثابت نگه می‌دارد. مطالعات پرجمعیت‌تری اخیراً گزارش شده است که میزان تشخیص (Detection rate) این روش را  برای تریزومی ۲۱ به میزان۱/۹۹ درصد و با ویژگی۷/۹۹ تا ۹/۹۹ درصد نشان می‌دهد.

 

به منظور آشنايی بيشتر با ارقام مورد بحث اگر فرض کنيم که کل موارد بارداری در ايران سالانه يک ميليون و سیصد هزار نفر باشد درصورت انجام غربالگری باروش جديدNIPT، منافع ذيل قابل دستيابی است:

۱- در روش رایج تعداد بيمارانی که با نتيجه مثبت کاذب جهت انجام آزمايش تأئيدی آمينوسنتز معرفی می­شوند تقریباً۶۵۰۰۰ بيمار است اما باروش NIFTY تنها ۴۴۲ نفر خواهند بود. بدين معنی که سالانه بيش از۶۴۵۰۰ مورد انجام روش آمنيوسنتز کمتر درخواست می‌شود.

۲- تعداد موارد سقط جنين به دليل ارجاع جهت نمونه‌گيری تهاجمی در روش اول تقریباً ۶۵۰ و در روش جدید فقط ۶ مورد می‌باشد.

۳- موارد منفی کاذب در روش غربالگری سنتی تقریباً ۳۲۵ مورد است، اما در روش جديد۱ یا ۲ مورد خواهد بود يعنی ۳۲۳  بيمار کمتر در يک سال.

باید توجه داشت که انجام این تست، نیاز به آزمایش (AFP)(6) را برای بررسیNTDs در سه ماهه دوم از بین نبرده و خانم باردار باید حتماً درهفته‌های ۱۵ تا ۲۰ بارداری مجدداً به آزمایشگاه مراجعه کند.

باید توجه داشت که هنوز در مورد کسانی که نتیجه تست cell free DNA آنها مثبت (پرخطر) می‌شود باید تست تأییدی مانند CVS یا آمنیوسنتز انجام شود، ولی با توجه به درصد مثبت کاذب بسیار پایین، تعداد مواردی که نیاز به این کار می‌باشد بسیار اندک خواهد بود.

 

مزایای تست: غیرتهاجمی بودن، برای انجام آزمایش فقط به چندمیلی ‌لیتر از خون مادر احتیاج است. حساسیت وصحت بالا، مطالعات بر روی جمعیت‌های بزرگ ویژگی و حساسیت بیشتر از ۹۹ درصد را نشان داده است. تشخیص زود هنگام، آزمایش ازهفته دهم بارداری قابل انجام بوده و این زمان به تصمیم‌گیری بهتر کمک می‌کند. اگرچه تا سال ۲۰۱۳ اکثر تحقیقات بر روی مفید بودن این تست در مورد بارداری‌های پرخطر انجام گرفته ولی در سال ۲۰۱۴ دو مرکز بسیار معتبر یعنی کالج ژنتیک پزشکی امریکا (۴)(ACMG) و کالج سلطنتی بیماری‌های زنان و زایمان (۵)(RCOG) و همچنین پروفسور Kypros Nicolaides کاربرد NIPT را به عنوان یک تست غربالگری با حساسیت بالا پیشنهاد کرده‌اند.

تا به حال بیش از ۸۰۰۰۰۰ مورد تست NIFTY انجام شده است که بالاترین تعداد در بین تست های NIPT در دنیا است

مواردکاربرد:

* به عنوان یک تست مرحله دوم، در مورد کسانیکه دارای پرخطر محسوب می شوند.
۱- خانم های بارداری که نتیجه تست غربالگری آنها مثبت شده است.
۲- زنان با سن بیشتر از ۳۵ سال
۳- زنان بارداری که در بررسی های سونوگرافی پرخطر تشخیص داده شده اند.
۴- کسانی که سابقه قبلی حاملگی با اختلالات کروموزومی دارند.
۵- فردی که از طریق IVF  باردار شده و یا قبلا سقط جنین تکراری داشته است.
۶- مواردی که منع استفاده از تست های تهاجمی دارند مثل Placenta Parvia، کسانی که خطر سقط جنین در آنها بالا است و افراد مبتلا به عفونت هپاتیت B.

* به عنوان یک تست غربالگری باقدرت تشخیص بسیار بالا، برای کسانی که نمی‌خواهند میزان ریسک منفی کاذب، در روش‌های رایج غربالگری را بپذیرند. * یک انتخاب به عنوان یک تست تأییدی برای زنانی که قادر به پذیرش خطر روش‌های تهاجمی نیستند، و یا از نحوه نمونه‌گیری در روش‌های تهاجمی وحشت دارند. * یک انتخاب برای مواردی که کشت سلولی با شکست مواجه می‌شود.

پیشنهادات: ۱-  خانم‌های باردار باید قبل از تصمیم‌گیری در مورد انتخاب روش مورد استفاده برای غربالگری و یا تأیید نتیجه مثبت (پرخطر) در روش‌های رایج غربالگری، مورد مشاوره قرار گرفته و از مزایا و معایب همه روش‌های موجود مطلع گردند. ۲- کاربرد این تست برای کسانیکه از نحوه نمونه گیری روشهای تهاجمی وحشت دارند.  ۳- انجام تستNIPT برای زنانی که نمی توانند خطر سقط در روشهای تهاجمی را بپذیرند مانند زنانی که پس از درمان‌های طولانی و پرهزینه و یا در سنین بالا باردار شده‌اند.

منابع

br />1-Glenn E. Palomaki, CosminDeciu, Edward M. Kloza, Geralyn M. Lambert-Messerlian, DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as down syndrome: an international collaborative study, Genetics in medicine ,Volume 14, Number 3,  March 2012

 

۲-Peter Benn, AntoniBorrell, Howard Cuckle, Lorraine Dugoff, Susan Gross, Prenatal Detection of Down Syndrome using Massively Parallel Sequencing (MPS): Prenatal Diagnosis, 24 October 2011

 

۳-Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, Tynan JA, Cagasan L, Tim R, Lu V, et al. Noninvasive detection of fetal Trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet.Gynecol 2011;204:205.e1–۲۰۵٫۱۱٫

 

۴-Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, Leung TY, Sun H, Chan KC, Lun FM, et al. Non-invasive prenatal assessment of Trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ 2011;342:c7401.

۵-Ashoor, G., Syngelaki, A., Wagner, M., Birdir, C., Nicolaides, K.H., Chromosome-selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18, Am J Obstet Gynecol. (2012), doi: 10.1016/j.ajog.2012.01.029.

 

۶-Chiu RWK, Akolekar R, Zheng YWL, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. Brit Med J. 2011;342:c7401

 

۷-Sparks, A.B., Struble, C.A., Wang, E.T., Song, K., Oliphant, A., Non-invasive Prenatal Detection and Selective Analysis of Cell-free DNA Obtained from Maternal Blood: Evaluation for Trisomy 21 and Trisomy 18, Am J Obstet Gynecol. (2012), doi: 10.1016/j.ajog.2012.01.030.

 

۸-RossaWK Chiu, RanjitAkolekar, YamaWLZheng, Tak Y Leung, Hao Sun…, Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scalevailidity study, BMJ 2011;342:c7401

 

۹٫TzeKinLau,Fang Chen, Xiaoyu Pan, Ritsuko K . Pooh, Fuman Jiang, YihanLi, Hui Jiang, Xuchao, Li,Shengpei Chen &Xiuqing Zhang, Noninvasive prenatal diagnosis of common fetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma DNA sequencing, Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 2012

۱۰-Shan Dan.,Fang Chen.,KwongWaichoy.,Fuman Jiang, Jingrong Lin, ZhaolingXuan, Wei Wang, Shengpei Chen, Xuchao Li …, Prenatal Detection of Aneuploidy and Imbalanced Chromosomal Arrangements by Massively Parallel Sequencing, PLoS ONE, February 2012, Volume 7, lssue 2

۱۱-Non Invasive Prenatal Testing for chromosomal abnormality using maternal plasma DNA. Scientific Impact Paper No. 15, March 2014 12-ACMG statement on noninvasive prenatal screeningfor fetal aneuploidy.Anthony R. Gregg, S.J. Gross, R.G. Best, K.G. Monaghan, K. Bajaj, B.G. Skotko,Genet Med advance online publication 4 April 2013
پانوشت
۱٫ Neural Tube Defects

۲٫ Basic Pair

۳٫ Chorionic Villus Sampling

۴٫ American College of Medical Genetics and Genomics

۵٫ Royal College of Obstetrics & Gynecology

۶٫ Alpha Feto Protein

۷٫ American Collage of meical Genetic and Genomics

۸٫ Royal Collage of Obstetrics & Gynecology

این مطلب را به اشتراک بگذارید

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *